[发明专利]一种用于阿尔茨海默病的治疗和预防的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途

权利要求书

1.一种用于阿尔茨海默病的治疗和预防的重组腺相关病毒基因疫苗的生成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、目的基因获取：

以SEQ ID NO.1所示的Aβ_15-30为对象，人工合成二价Aβ_15-30，并将其与序列如：SEQ IDNO.2所示的GM-CSF佐剂串联，经密码子优化得到如SEQ ID NO.3所示的编码序列；

2）、AAV表达质粒构建：

将所述如SEQ ID NO.3所示DNA片段与AAV表达质粒进行连接；将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，进行大量培养，并采用无内毒素质粒大量提取试剂盒进行质粒大量提取，测定质粒浓度，-40℃保存备用；

3）、AAV表达质粒与辅助质粒共转染：

将AAV表达质粒与辅助质粒按照1:3（共2μg）的比例混合，共转染入宿主细胞，将质粒混合液与2μL转染试剂在500μL的opti-MEM培养液混匀，将混合液室温静置30-60min，然后将混合液加入到宿主细胞中，在37℃，5%CO₂恒温箱中处理2h，并补加1.5mL2%FBS的DMEM培养液后，再继续培养10-15天，直到出现CPE现象；将出现CPE细胞液继续接种至新的宿主细胞，稳定遗传20代次；

4）、重组腺相关病毒增殖：

在转染后10-15天，宿主细胞出现CPE现象，将细胞在-80℃反复冻融3次，收集到离心管中后，3000rpm，离心10min，收集上清液；向含有宿主细胞的六孔板中接种重组腺相关病毒，接种36-48h后，再在-80℃条件下进行冻融，收集病毒，即为：重组腺相关病毒基因疫苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中的AAV表达质粒为pAAV-IRES-GFP质粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中的连接步骤包括BamHI酶切AAV表达质粒和采用T4DNA连接酶连接的过程；其中，所述酶切体系为50μL，其包括：20μL质粒，4μLBamHI，5μL10×buffer，21μLddH₂O；连接体系为10μL，其包括：1μL T4DNA连接酶，3μLpAAV-IRES-GFP质粒，5μL如SEQ ID NO.3所示的DNA片段，1μL10×buffer。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中的辅助质粒为AAV Helper FreePackaging System。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3-4）中宿主细胞为HEK293。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中转染试剂为ViraDuctin™腺相关病毒转染试剂。

7.一种由权利要求1-6任一项所述方法制备得到的治疗和预防阿尔茨海默病的重组腺相关病毒基因疫苗。

8.权利要求7所述的重组腺相关病毒基因疫苗在制备用于治疗和预防阿尔茨海默病的药剂中的用途，其特征在于，所述重组腺相关病毒基因疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。

9.如权利要求1-6任一项所述方法或权利要求7所述的重组腺相关病毒基因疫苗或权利要求8所述的用途，其特征在于，所述腺相关病毒载体疫苗的剂型包括但不限于口服剂、注射剂、气雾吸入剂等常见的疫苗剂型。

10.如权利要求1-6任一项所述方法或权利要求7所述的重组腺相关病毒基因疫苗或权利要求8所述的用途，其特征在于，所述腺相关病毒载体疫苗还可以和其他用于阿尔茨海默病的药物联用。