[发明专利]一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法

权利要求书

1.一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向细菌细胞中引入含有缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，筛选出敲除质粒通过单交换同源重组整合到细菌细胞染色体中的细菌细胞；

(2)转化含有目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒，筛选出含有回补质粒的细菌细胞；

(3)通过环出效应切除细菌细胞基因组中的部分片段，而后筛选出切除了目的基因并保留缺失目的基因等位基因的细菌细胞；

(4)对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析。

2.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(S1)用渗透物将细菌细胞制备成电感受态细胞，通过电穿孔或接合的转化方法，引入含有用于筛选转染成功的细胞的抗药基因A、反向选择标记基因a和目的基因自身启动子加上其缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，敲除质粒通过单交换同源重组整合到细胞染色体中；用与抗药基因A对应的药物A筛选，得到敲除质粒转染成功的细菌细胞；

(S2)转化含有与抗药基因A不同的抗药基因B、用于观察表型的基因b和目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒；用与抗药基因B对应的药物B筛选，得到回补质粒转染成功的细菌细胞；

(S3)使用反向选择标记基因a进行负筛选，得到通过环出效应切除敲除质粒的细菌细胞；(S4)使用药物A、药物B和反向选择标记基因a对细菌细胞进行表型检查，细胞对反向选择标记基因a和药物A敏感，培养细胞；

(S5)使用引物特异性PCR对细胞染色体环出序列进行检测，保留染色体缺失目的基因的缺失突变体细胞；

(S6)培养缺失突变体细胞，控制用于观察表型的基因b表达并观察细胞，进行表型评估分析。

3.根据权利要求2所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，所述敲除质粒的制备方法包括以下步骤：

以质粒1为原料，将抗药基因A、反向选择标记基因a通过同源重组克隆，产生质粒1-A-a；将目的基因缺失盒克隆到质粒1-A-a中，得到敲除质粒1-A-a；目的基因缺失盒包含带有中间缺失目的基因编码的上游和下游序列。

4.根据权利要求2所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，所述回补质粒的制备方法包括以下步骤：

以具有复制子的质粒2为原料，将抗药基因B、用于观察表型的基因b通过同源重组克隆，产生质粒2-B-b；将目的基因互补盒克隆到质粒2-B-b中，得到目的基因回补质粒2-B-b；目的基因互补盒包含自身启动子和目的基因野生型编码序列。

5.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，在所述步骤(4)之后，通过目的基因的直系同源物进行功能互补分析。

6.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，在所述步骤(4)之后，分离缺失突变体的抑制子。

7.根据权利要求6所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，所述分离缺失突变体的抑制子的方法包括，使缺失突变体细胞自发突变，得到含有缺失目的基因等位基因的突变株。

8.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析的方法包括旁路抑制。

9.敲除PA0006基因的菌株在降低假单胞菌致病性的药物中的应用。

10.敲除PA0006基因的菌株在研究细胞壁脂多糖O抗原生理功能中的应用。