[发明专利]一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法

说明书

本发明属于植物组织培养类的化妆品原料领域，公开了一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法。该方法包括无菌叶片的获得、愈伤组织诱导、愈伤组织的继代增殖、悬浮细胞的培养和筛选，规模性放大培养，高产绿原酸诱导。该方法以沙漠蔷薇植株新鲜幼嫩叶片为外植体，可快速诱导细胞脱分化形成愈伤组织，愈伤组织经过固体继代及液体震荡培养，筛选获得可进行高密度悬浮培养细胞系，其可以在一个培养周期内，约5～7天沙漠蔷薇悬浮细胞鲜重就达到600‑800g/L；本发明悬浮细胞生长速度快、可耐受高转速、可实现高密度培养，使得该技术具有耗时短、成本低，获得的悬浮细胞密度高等特点。

技术领域

本发明属于植物组织培养类的化妆品原料领域，特别涉及一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法。

背景技术

沙漠蔷薇(Adenium Obesum.)，又名沙漠玫瑰，天宝花，是夹竹桃科沙漠玫瑰属，为多年生落叶肉质植物，原产东非至阿拉伯半岛南部，该地区地处赤道附近，常年干旱少雨，光照充足。特殊的地理环境造成沙漠蔷薇喜高温干燥和阳光充足的环境，耐酷暑，耐干旱，能在恶劣的环境中生长，能够从干燥的沙漠环境中获取水分，有很强的保水能力。

沙漠蔷薇提取物有很好的药用价值和美容功效，沙漠蔷薇中可提取出30种强心苷和2种孕烷，可用于治疗心脏病和妇科病。沙漠蔷薇叶提取物具有保湿润肤，抗衰老等美容功效。沙漠蔷薇花提取物含高浓度海藻糖，有减少晒黑和皮肤老化、有效提高肌肤的储水功能。

沙漠蔷薇自花结实率低，不容易长果荚，种子少，收集难；且人工授粉较难，操作成功率低，一般是用半成熟枝扦插来栽培，但繁殖速度慢，易出现根腐病。因此，依靠种植实生苗或扦插苗提取功效成分，存在资源不足的问题。

专利CN 104622759 A中指出原料沙漠蔷薇叶细胞提取物的常规制备方法是利用新鲜、无杂质的沙漠蔷薇叶经水蒸气蒸馏法获得，但得率非常低，仅有万分之三。

专利CN 111280063 A利用沙漠蔷薇成熟种子萌发为无菌苗，以无菌苗的茎、叶片和根为外植体获得愈伤组织，得到沙漠蔷薇悬浮细胞系，进行规模化培养，解决了沙漠蔷薇细胞产量不足的问题。但是，该专利是利用种子作为外植体，而沙漠蔷薇存在种子少，收集难问题，同时，需要种子进行萌发获得无菌苗，再进行愈伤组织诱导，操作繁琐，周期长。并且放大生产需要利用到CN103224882A或CN204385208U的中国专利文献所披露的昂贵生物反应器，致使其进一步应用受到制约。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法；该方法以沙漠蔷薇植株新鲜幼嫩叶片为外植体，可快速诱导细胞脱分化形成愈伤组织，愈伤组织经过固体继代及液体震荡培养，筛选获得可进行高密度悬浮培养细胞系，其可以在一个培养周期内，约5～7天沙漠蔷薇悬浮细胞鲜重就达到600-800g/L；本发明悬浮细胞生长速度快、可耐受高转速、可实现高密度培养，使得该技术具有耗时短、成本低，获得的悬浮细胞密度高等特点。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织诱导、愈伤组织的继代增殖、悬浮细胞的培养和筛选，规模性放大培养，高产绿原酸诱导。

一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法，具体包括以下操作步骤：

(1)取沙漠蔷薇的幼嫩叶片，按照常规的消毒方法对其进行消毒处理；

(2)将步骤(1)灭菌处理过的叶片切除叶边缘，横切过叶中脉，切成2～3cm见方小块接入诱导培养基中进行诱导培养，温度24℃，湿度70～80％，避光暗培养；