[发明专利]一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法及应用在审
| 申请号： | 202210930591.7 | 申请日： | 2022-08-04 |
| 公开（公告）号： | CN116064344A | 公开（公告）日： | 2023-05-05 |
| 发明（设计）人： | 罗茂行;吴玉玲;王甜忆;董洪钢 | 申请（专利权）人： | 浙江熙正霖生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/55;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/70;C12P7/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 无锡科嘉知信专利代理事务所(普通合伙) 32515 | 代理人： | 顾翰林 |
| 地址： | 311100 浙江省杭州市余*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 发酵 生产 羟基 重组 大肠杆菌 构建 方法 应用 | ||
1.一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤，步骤一、PCR扩增获取HpaBC、LAAD基因和线性化pRSFDuet-1载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pRSFDuet-HpaBC-LAAD；PCR扩增获取ARO10、ADH基因和pRSFD uet-HpaBC-LAAD载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pRSFDuet-HpaBC-LAAD-ARO10-ADH；PCR扩增获取AROG、TYRA基因和线性化pETDuet-1载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pETDuet-AROG-TYRA；
步骤二、将质粒pRSFDuet-HpaBC-LAAD-ARO10-ADH和质粒pETDuet-AROG-TYRA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组大肠杆菌BLAH，以及将质粒pRSFDuet-1和pETDuet-1共同转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组大肠杆菌BLCK。
2.一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的应用，其特征在于，将权利要求1中重组大肠杆菌应用于发酵生产羟基酪醇。
3.如权利要求2所述的发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的应用，其特征在于，通过重组大肠杆菌表达6种酶：羟化酶、L-α-氨基酸脱氨酶、α-酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、2-脱氢-3-脱氧磷酸庚酯醛缩酶和分支酸突变酶/苯甲酸酯脱氢酶。
4.如权利要求2所述的发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌生产方法，包括如下步骤，
步骤一、将携带有质粒pRSFDuet-HpaBC-LAAD-ARO10-ADH和质粒pETDuet-AROG-TYRA的重组大肠杆菌BLAH和携带有质粒pRSFDuet-1和pETDuet-1的重组大肠杆菌BLCK于LB培养基中培养；
步骤二、按0.5～2％的接种量接入TB培养液中扩大培养，然后加入0.1～0.3mM的诱导剂进行诱导培养，以及在30℃，220r/min下继续培养进行产物的积累，每隔8小时液相色谱检测羟基酪醇产量。
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