[发明专利]一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法在审
| 申请号： | 202210930634.1 | 申请日： | 2022-08-04 |
| 公开（公告）号： | CN116064429A | 公开（公告）日： | 2023-05-05 |
| 发明（设计）人： | 邓卉;余丹;梁歌;邹成义;范景胜;陈瑾;李斌;屈东;郑钰嘉;倪青松;汪林书 | 申请（专利权）人： | 四川省畜牧科学研究院 |
| 主分类号： | C12N9/02 | 分类号： | C12N9/02;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/53;C12N1/21;C12N1/38;A23L5/20;C12R1/19 |
| 代理公司： | 成都九鼎天元知识产权代理有限公司 51214 | 代理人： | 胡东东 |
| 地址： | 610066 *** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 重组 大肠杆菌 高效 表达 方法 | ||
1.一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、按照现有方法提取大肠杆菌SDB2基因组，设计PCR引物，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行PCR扩增，得到目标PCR产物；其中，大肠杆菌SDB2的保藏编号为CCTCC M20221114；
S2、回收纯化目标PCR产物，将目标PCR产物与原核表达载体pET28a连接构建出重组质粒pET28a-Lac；
S3、将重组质粒pET28a-Lac转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，筛选出PCR鉴定为阳性的重组菌株BL21/pET28a-Lac；
S4、将重组菌株BL21/pET28a-Lac接种到液体培养基中进行培养，得到的菌液再接种至诱导培养基中诱导漆酶基因表达；
S5、诱导培养结束后离心收集菌体，菌体经悬浮、破碎、离心后得到漆酶蛋白。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，所述诱导培养基的组成为：0.2～1mM/L的IPTG、1～10mM/L的CuCl2、1～10mM/L的MnSO4、1～10mM/L的FeSO4、1～10mM/L的CaCl2、0.1～2g/L的菜粕汁、0.1～2g/L的白芥子汁、0.1～2g/L的棉籽粕汁。
3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，所述PCR引物包括YfiH-F引物和YfiH-R引物，YfiH-F引物和YfiH-R引物的序列如下：
YfiH-F：CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCAAACTGATTGTTCCGCAGTGGCCGCT；
YfiH-R：AGCCGGATCTCAGTGGTGGT
GGTGGTGGTGCTCGAGTTAAATCAGC CAAATAAAGCTGGCCATGC。
4.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，所述目标PCR产物为741bp的漆酶基因，漆酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
5.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，所述液体培养基为含有30±5μg/ml卡拉霉素的液体培养基。
6.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，在步骤S1中，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行两轮PCR扩增反应，扩增产物经0.8w％琼脂糖凝胶电泳处理，得到目标PCR产物。
7.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，在步骤S2中，将纯化后的目标PCR产物经Nde l和Xho l双酶切后，与同样经Nde l和Xho l双酶切的表达载体pET-28a(+)用DNA连接酶进行连接，构建出重组质粒pET28a-Lac。
8.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，在步骤S5中，向收集到的菌体中加入Tris-NaCl buffer悬浮，超声破碎，离心收集上清制样，即得到漆酶蛋白。
9.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为上述权利要求1-8任一所述的方法制备得到的重组菌株BL21/pET28a-Lac，该重组菌株用于降解植物中的多酚类物质。
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