[发明专利]一种辅助鉴别白杨派植物方法及使用试剂盒

权利要求书

1.一种辅助鉴别白杨派植物方法，具体步骤如下：

S1,杨树扩展蛋白1即为EXPA1基因同源片段引物设计：利用毛果杨EXPA1基因DNA全长序列中820bp～885bp的片段引物对1；

S2,五大派杨树基因组DNA EXPA1基因同源片段获得：提取五大派的代表杨树DNA，利用序列表中的引物对1对以上模板进行PCR扩增；其次，将这5个杨树EXPA1基因同源片段进行克隆测序；

S3,白杨派特有引物对获得：将获得的上述五大派杨树EXPA1基因同源序列比对，挑选白杨派在比对序列中缺失部分，作为白杨派区别其他四大派杨树的特有序列，设计引物，即为引物对2；

S4,验证特异引物对2的准确性：将收集的五大派杨树共计21份样本使用引物对2进行PCR验证，结果显示，白杨派的5个树种在扩增结果中均有368bp的特异条带出现，而其他四大派杨树均没有条带产生；

S5,初步鉴定五莲杨在五大派杨树中的分类地位：分别提取五莲杨雌株、雄株DNA，利用引物对2进行PCR扩增，电泳结果显示，两样本均有368bp特异条带产生，说明五莲杨雌株、雄株均属于白杨派树种；

其中，所述五大派杨树分别为白杨派、胡杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派；

所述选取的五大派杨树代表树种分别为：白杨派的‘Lumao50’、胡杨派的胡杨、黑杨派的欧美杨107(Populus×euramericana Neva)、青杨派的小叶杨、大叶杨派的大叶杨。

2.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别白杨派植物方法及使用试剂盒，其特征在于：所述选取的毛果杨基因组DNA EXPA1基因的片段序列位于第二个和第三个外显子之间，利用DNAMAN软件设计引物对，使其扩增产物在820bp～885bp。

3.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别白杨派植物方法及使用试剂盒，其特征在于：所述的五大派杨树EXPA1基因同源片段序列获得，包括PCR产物胶回收，连接克隆载体，转化大肠杆菌后阳性筛选和质粒提取后基因测序。

4.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别白杨派植物方法及使用试剂盒，其特征在于：所述的白杨派与其他四个派系差异较大片段的区别在于部分作为引物对的上游引物，下游引物在350bp处。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的一种辅助鉴别白杨派植物方法及使用试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增体系为：引物对列表中的引物对浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq即为Ex Taq Version 2.0 plus dye，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。

6.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别白杨派植物方法及使用试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。

7.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别白杨派植物的试剂盒，其特征在于：利用以上方法可形成能够鉴定白杨派杨树的试剂盒，其试剂盒包括能够区别其他四大派杨树引物对2，PCR扩增体系和PCR扩增条件。

8.根据权利要求7所述的一种辅助鉴别白杨派植物的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增体系为：引物对列表中的引物对浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μlPremix Taq即为Ex Taq Version 2.0plus dye，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。

9.根据权利要求7所述的一种辅助鉴别白杨派植物方法的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。

10.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别白杨派植物方法，其特征在于：所述引物对1的片段大小为820bp～885bp，其中引物对1包括PtA1F和PtA1R，其中PtA1F的引物序列为5'-CCCAACAACAACCTTTATGG-3'，PtA1R的引物序列为5'-CAACCAGAACAGCGTTTGAC-3'；

所述引物对2的片段大小为368bp，其中引物对1包括PtA2F和PtA2R，其中PtA2F的引物序列为5'-GCAGCACTTTTTCTTAGTATT-3'，PtA2R的引物序列为5'-CTCATGCTCATCCAACCAGT-3'；

具体的序列5引物对PtA1F/PtA1R对基因EXPA1片段进行扩增的序列为白杨派‘Lumao50’:

CCCAACAACAGCCTTTATTGCCCCAAAACAATAGCTCTCTGAAGCCATGAAAATATACTCGAGAGGTTGGCAGAAGAACATCCACGATAACTGCCAAAAAAACCTATTTTTGGTGGGTCTTTATCGTTTTTGGCAACCAATTTTCTACCTTTGAATTCTTGTTGTGATCCAAAAATTTGTTTAACTGAAGTCACCAAACAGTTATGAACGGGCTGATGTAATTAAGTGACGTCGGTGGGTTAGTTGGACCTCAACAACTTTCTCTTGTGTCCTTCACTTATTTTAGCCACGGGACCGTTTATGGTCGCCTTCGGTGATTTGTTTTTACTCTTATCGCCCCGCTTTAGTACTAAAAATACCAATGCACCCTTGCCCTATTCGTTTCTACGCTTCCCCTTCTGCACAAAGGTGGATAGCCACGCCATACTGCAGCTCTTTTTCTTAGTATTCTAGTGAGAAAATCAAATCATTTCGTCAAACACCGAAACCCAAAAATCACACTTCCCAAAATCCTAGACTTCCATGTTTATGTTTTGTTTTTTGTTAATGCATAGGTTAGGGTTGCTGTTTTCCTTGACTGCCCTTTTTGTAAATTTGTTTTATTGTCGCAATTACGGAAGTGTCCTAACGGCATTGAACTACTATGCAGAGTGCCATGCCGCAAGAGGGGAGGCATAAGGTTCACAATAAACGGATTCCGTTACTTCAACTTGGTATTGATCAGCAACGTGGCGGGTGCAGGGGATATAGTGCAGGTGAGCGTGAAGGGTTCAAAGACTGGTTGGATGAGCATGAGCCGTAACTGGGGCCAGAACTGGCAGTCAAACGCTGTTCTGGTTG；

具体的序列6引物对PtA2F/PtA2R对基因EXPA1片段进行扩增的序列为白杨派‘Lumao50’:

GCAGCTCTTTTTCTTAGTATTCTAGTGAGAAAATCAAATCATTTCGTCAAACACCGAAACCCAAAAATCACACTTCCCAAAATCCTAGACTTCCATGTTTATGTTTTGTTTTTTGTTAATGCATAGGTTAGGGTTGCTGTTTTCCTTGACTGCCCTTTTTGTAAATTTGTTTTATTGTCGCAATTACGGAAGTGTCCTAACGGCATTGAACTACTATGCAGAGTGCCATGCCGCAAGAGGGGAGGCATAAGGTTCACAATAAACGGATTCCGTTACTTCAACTTGGTATTGATCAGCAACGTGGCGGGTGCAGGGGATATAGTGCAGGTGAGCGTGAAGGGTTCAAAGACTGGTTGGATGAGCATGAG。