[发明专利]用于前列腺癌筛查的标记物、试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于前列腺癌筛查的尿液外泌体标记物，其特征在于，所述尿液外泌体标记物为PCA3、TMPRSS2-ERG、SPDEF、HAAH和AMACR。

2.一种用于前列腺癌筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含五种标记物的反应液和β-actin反应液；β-actin反应液中的前引物序列如SEQ ID NO:1所示，后引物序列如SEQ ID NO:2所示；通过逆转录聚合酶链反应检测尿外泌体中的PCA3、TMPRSS2-ERG、SPDEF、HAAH和AMACR表达水平。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，五种标记物的反应液均包括：PCRbuffer，MgCl₂，dNTP，taq聚合酶，前引物，后引物，探针；其中，PCA3反应液中的前引物序列如SEQ ID NO:3所示，后引物序列如SEQ ID NO:4所示；TMPRSS2-ERG反应液中的前引物序列如SEQ ID NO:5所示，后引物序列如SEQ ID NO:6所示；SPDEF反应液中的前引物序列如SEQID NO:7所示，后引物序列如SEQ ID NO:8所示；HAAH反应液中的前引物序列如SEQ ID NO:9所示，后引物序列如SEQ ID NO:10所示；AMACR反应液中的前引物序列如SEQ ID NO:11所示，后引物序列如SEQ ID NO:12所示。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，检测五种标记物的反应液均包括：1X的PCR buffer，2mM的MgCl₂，0.2mM的dNTP，0.03U/ul的taq聚合酶，前引物 0.2μM，后引物0.2μM，探针0.08 μM，余量为去离子水。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，β-actin反应液包括：PCR buffer，MgCl2，0.2mM的dNTP，taq聚合酶，β-actin的前引物 0.2μM，β-actin的后引物0.2 μM，β-actin探针。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，β-actin反应液包括：终体系1X的PCRbuffer，2mM的MgCl₂，0.2mM的dNTP，0.03U/ul的taq聚合酶，β-actin前引物 0.2μM，β-actin后引物0.2 μM，β-actin探针0.05 μM，去离子水补充至20ul。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为质粒DNA；所述阴性对照为tris-HCl；所述试剂盒还包括外泌体提取试剂，所述外泌体提取试剂按体积百分比包括：18% PEG6000和10% PEG800，余量为PBS缓冲液。

8.一种权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：

（1）收集尿液，提取尿液外泌体；

（2）尿液外泌体中加入外泌体裂解液，提取mRNA；

（3） mRNA反转录成cDNA；

（4）通过逆转录聚合酶链反应，检测PCA3、TMPRSS2-ERG、SPDEF、HAAH和AMACR表达。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤（1）具体为：

第一步：收集尿液，备用；

第二步：将尿液进行离心，上清液转入新的离心管，加外泌体提取试剂，4℃过夜；

第三步: 将所述上清液进行第二次离心，弃上清，收集外泌体沉淀，-80℃保存；

第四步: 将外泌体沉淀中加入350ul外泌体裂解液，提取mRNA。

10.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，步骤（4）具体为：

按反应布局，向96孔板中加入20 ul的反应液；外泌体cDNA稀释10倍，每个反应孔内加入10ul 的稀释后的cDNA ；阳性对照用每反应1000拷贝的质粒DNA，阴性对照用tris-HCl；在ABI PCR仪上进行PCR反应。