[发明专利]一种高效嗜热基因打靶系统及其应用

权利要求书

1.用于高效嗜热基因打靶系统的靶位点DNA识别序列，其特征在于：所述靶位点DNA识别序列由如下结构组成：A(-15)A(-14)xxxxxX(-8)xxxxxxxNA(+1)；其中，A(+1)表示靶位点下游的第1个碱基为A，A(-15)和A(-14)表示靶位点上游的第14和第15两个位点碱基为A；X(-8)表示靶位点上游的第8个位点IBS2b，所述IBS2b位点与内含子RNA的EBS2b位点互补配对；x表示与内含子RNA相互识别的碱基，N表示靶位点。

2.根据权利要求1所述的靶位点DNA识别序列，其特征在于：靶位点上游的第7个位点x为IBS1，所述IBS1位点与内含子RNA的EBS1位点互补配对；靶位点上游的第6个位点x为IBS2，所述IBS2位点与内含子RNA的EBS2位点互补配对；靶位点上游的第5个位点x为IBS3，所述IBS3位点与内含子RNA的EBS3位点互补配对。

3.根据权利要求1或2所述的靶位点DNA识别序列，其特征在于：所述识别位点IBS2b、IBS1、IBS2和IBS3均为A、T、G、C四个碱基中的任意一个。

4.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求1-3中任意一项所述的靶位点DNA识别序列的表达载体。

5.如权利要求1-3中任意一项所述的靶位点DNA识别序列的应用，其特征在于：用于高效嗜热基因打靶系统中靶位点的识别，进而使得靶位点被敲除。

6.高效嗜热基因打靶系统，其特征在于：所述打靶系统由嗜热II型内含子RNA和内含子编码蛋白（IEP）组成；其中，所述内含子RNA序列包含四个特征性的外显子识别序列EBS2、EBS2b、EBS1和EBS3；靶位点上包含四个特征性的内含子结合序列IBS2、IBS2b、IBS1和IBS3，所述外显子识别序列与所述内含子结合序列通过碱基互补配对相互识别，形成EBS2/IBS2，EBS2b/IBS2b，EBS1/IBS1和EBS3/IBS3配对，确定系统在染色体上的打靶位点，进而实现靶位点的敲除。

7.根据权利要求6所述的高效嗜热基因打靶系统，其特征在于：所述打靶系统用于嗜热微生物和可短暂耐高温的中温微生物。

8.根据权利要求7所述的高效嗜热基因打靶系统，其特征在于：所述嗜热微生物是指最适生长温度高于45℃的微生物；所述可短暂耐受高温微生物是指能够短暂耐受45℃及以上温度的微生物。

9.如权利要求6-8中任意一项所述的高效嗜热基因打靶系统的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）筛选打靶位点：根据权利要求2所述的靶位点DNA识别序列筛选打靶位点；

（2）设计打靶引物：根据步骤（1）筛选的打靶位点设计打靶引物，改变内含子RNA上的四个特征性外显子识别序列，实现对打靶位点的识别；

（3）构建打靶质粒：以嗜热II型内含子打靶质粒pHK-TTA1为模版，采用步骤（2）所述的打靶引物，通过PCR扩增特异性打靶片段，并在双酶切后与同样双酶切的pHK-TTA1质粒连接，使特异性打靶片段取代pHK-TTA1质粒上的打靶片段，得到高效嗜热基因打靶质粒，即可进行打靶。

10.根据权利要求9所述的高效嗜热基因打靶系统的使用方法，其特征在于：步骤（2）所述的打靶引物为：

Tel3c-UNV：TAACGAGGCTTCTAGCG；

IBS12：AGCCAAAGCAGGTTGACTAGTAAxxxxxXxxxxxxxGTGCGACGCGAAAGCTAG；

EBS2：CGCTAGAAGCCTCGTTXxxxxxAGCAGGCCAAAGATGCTG；

EBS1a：CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAxxxxxxAGCAGCGTATCCAATCC；

其中，引物Tel3c-UNV为通用引物；引物IBS12中大写X前的xxxxx与引物EBS2中的5个x相互识别形成 EBS2/IBS2配对；引物IBS12中的大写X与引物EBS2中的大写X相互识别形成EBS2b/IBS2b配对；引物IBS12中大写X后的xxxxxxx与引物EBS1a中的6个x相互识别形成EBS1/IBS1配对。