[发明专利]一种双酶偶联催化5-羟甲基糠醛还原合成2,5-呋喃二甲醇的方法

权利要求书

1.一种双酶偶联催化5-羟甲基糠醛还原合成2,5-呋喃二甲醇的方法，其特征在于，所述方法为：将醇脱氢酶基因工程菌和葡萄糖脱氢酶基因工程菌各自经诱导表达获得的菌体冻干，获得的醇脱氢酶冻干菌粉与葡萄糖脱氢酶冻干菌粉混合后作为催化剂，以5-羟甲基糠醛为底物，以葡萄糖为辅底物，以NADP⁺为辅酶，以pH 4～9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度为20～50℃，400rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，获得2,5-呋喃二甲醇。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇脱氢酶基因工程菌是将醇脱氢酶基因导入大肠杆菌构建获得的；所述醇脱氢酶基因包括但不限于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醇脱氢酶YsADH、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的醇脱氢酶AdhP、核苷酸序列如SEQID NO.5所示的醇脱氢酶YahK、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的醇脱氢酶YjgB。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌是将葡萄糖脱氢酶基因导入大肠杆菌构建获得的；所述葡萄糖脱氢酶基因包括但不限于葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所示醇脱氢酶冻干菌粉与葡萄糖脱氢酶冻干菌粉以质量比0.2～5:1混合。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，催化剂加入量为20～40g/L；所述底物加入终浓度为500～1300mM，所述底物与葡萄糖加入浓度比为1:0.5～2.5；所述辅酶加入终浓度为0～0.5mM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应温度为30℃，反应介质为pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，当底物添加量为低于或等于700mM时，底物和辅底物一次性加入反应体系；当底物添加量高于700mM时，底物和辅底物分别采用恒速连续流加的方式加入。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流加底物为5-羟甲基糠醛原液，流加辅底物为1.2～1.8M的葡萄糖水溶液；所述底物和辅底物各自以10～360μmol/min的速度流加1～18h，流加结束后继续反应0～7h；所述底物和辅底物流加速度相同，底物累积添加量为500-1300mM。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在10mL反应体系中，糠醛和葡萄糖的恒定流加速度均为11.9μmol/min，流加时间为18h，流加结束后继续反应7h；在300mL反应体系中，糠醛和葡萄糖的恒定流加速度均为357.1μmol/min，流加11h后反应停止。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇脱氢酶冻干菌粉和葡萄糖脱氢酶冻干菌粉按如下方法制备：分别将醇脱氢酶基因工程菌和葡萄糖脱氢酶基因工程菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0～0.6mM的IPTG，在12～36℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0的50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；将得到的湿菌体放于-20℃预冻两天后，放于冷冻干燥仪中-40℃冻干48h，获得各个冻干菌粉。