[发明专利]一种从感染疫病的辣椒叶片中提取胞间液的方法

权利要求书

1.一种从感染疫病的辣椒叶片中提取胞间液的方法，其特征在于：包括，

培养辣椒叶片并采集、病原菌侵染、冲洗叶片、吸水纸擦干、叶片浸入渗透缓冲液，试管抵压使其浸没、真空处理、缓慢打开瓶塞，待叶片全部吸水后取出，吸水纸擦干，封口膜包裹叶片，放入注射器中，离心，吸取底部液体移至新的离心管，二次离心，吸取上清，超低温保存样品。

2.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述培养辣椒叶片是在22～24℃、光照16h/黑暗8h的温室中培养辣椒苗。

3.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述采集辣椒叶片6周后采集辣椒叶片，采样前1h给辣椒浇水，保证叶片相同膨压。

4.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述病原菌侵染将辣椒叶片浸泡在浓度约600个游动孢子/μL的辣椒疫霉游动孢子悬浮液中，浸泡3h后取出叶片，放在25℃恒温培养箱中孵育3h。

5.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述浸入渗透缓冲液将3～6片新鲜的辣椒叶片放入1L真空抽滤瓶中，加入500mL左右的超纯水，用试管抵压叶片使其浸没。

6.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述真空处理是以小于2Pa压力值处理10～15s，缓慢打开瓶塞，待整张叶片被浸润后取出叶片，用吸水纸擦干叶片表面。

7.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述离心为剪取10cm×10cm的封口膜，将叶片按同一方向摆放在封口膜上，封口膜一端放一个1mL的移液器枪头作为支撑，慢慢从枪头方向卷起叶片，整个放入10mL塑料注射器内，再将注射器放入50mL离心管中，于4℃、1000g离心10min。

8.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述二次离心条件为4℃、15000g离心5min。

9.如权利要求1所述提取胞间液的方法，其特征在于：所述超低温保存样品，在保存样品前需要对提取物进行检测，利用试剂盒，测定胞间液的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性，评估胞间液受胞内物质污染的程度。

10.如权利要求9所述对提取物检测的方法，其特征在于：所述污染率低于3％即认为原生质对胞间液的污染可忽略不计，将胞间液保存在-80℃超低温冰箱中。