[发明专利]一种应用iTRAQ技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法

说明书

本发明涉及一种鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法，该方法采用iTRAQ技术对冰鲜和冻融处理三文鱼中的蛋白进行定量和定性分析，筛选出与三文鱼冻融后品质变化相关的差异蛋白，并利用多反应检测模式对这些蛋白做了进一步验证，为解释冻融处理后的三文鱼品质变化规律奠定了理论基础。本发明的鉴别方法为三文鱼品质评价和控制提供了研究思路和科学依据，也为进口的三文鱼品质鉴别提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种应用iTRAQ技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法。

背景技术

在众多生食鱼片中，三文鱼凭借其颜色鲜艳、肉质细嫩、肥而不腻的口感和丰富的营养价值，成为众多消费者的首选。日式料理店中的三文鱼刺身、超市中销售的可生食三文鱼肉等都需要经过冷链物流的运输。特别是冰鲜三文鱼，需要在捕捞后短时间内将温度降到0℃左右，随即包装运输，在运输和存储过程中，均严格控制在一定的温度范围内。温度始终处于冰点临界点，以保持肉质的柔软，同时适当的低温又能防止细菌繁殖，如此一来口感和营养都最大程度地保留了下来，保持了三文鱼细胞活体状态和食用口味鲜美。但这需要尽快从生产地运达目的地，导致物流成本较高，因此一些商家为了降低运输成本，延长保存时间，会将三文鱼进行冷冻运输，在这个过程中，细胞内部分水冻结形成冰晶，体积增加，从而引起细胞膜刺穿、破裂及部分肌肉纤维空间结构损伤；然后在解冻过程中，因细胞膜和肌纤维的损坏，导致体内大量的营养物质伴随着汁液流失而减少。因此，相比冰鲜三文鱼，冻融后的三文鱼口感较差、营养损失较多，市场价值也就大打折扣，且潜在的寄生虫和病原菌微生物还对消费者的身体健康带来严重威胁。

针对市场上冻融三文鱼“以次充好”的现象，有必要对其进行检测。传统的冻融鱼类鉴别技术有感官评价、微生物检测和理化分析，但感官识别技术需要依靠专业的人员，且评价结果具有一定的主观性，而微生物和理化方法操作复杂。相比于以上技术，光谱技术和电子鼻、电子舌等无损检测技术克服了其操作复杂、消耗时间长的缺点，可以通过建立不同的判别模型，来实现对新鲜和冻融样品的精准鉴别。但这些技术只能从变化终端入手，无法深入了解冻融处理后三文鱼品质机理方面的变化过程。

反复冻融对三文鱼品质方面的影响有很多，其中蛋白质作为鱼类肌肉组织的主要成分之一，其结构与功能特性对鱼类品质的影响较为显著，而质谱和蛋白组学研究技术的不断发展为进一步探究冻融后三文鱼品质变化的机理提供了技术支持。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技术是一种多肽体外标记技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高分辨率质谱仪分析，可同时比较多达8个样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术，同时结合生物信息学分析可进一步探明冻融处理后三文鱼品质机制。

因此尚未见应用iTRAQ技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前中国市场上三文鱼标签混乱、以次充好等现象，提供一种应用iTRAQ技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法，通过iTRAQ蛋白组学技术，进一步结合MRM验证，对冰鲜和冻融的三文鱼中蛋白进行定量和定性分析，获得冰鲜和冻融三文鱼蛋白组的变化。

针对上述目的，本发明第一方面提供一种应用iTRAQ技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法，其包含以下步骤：

(1)采集冰鲜和冻融处理的三文鱼样品，提取样品中的蛋白；

(2)对步骤(1)获得的蛋白质样品进行酶解、iTRAQ标记、分离肽段及LC-MS质谱分析；

(3)对步骤(2)获得的蛋白质谱数据进行定性和定量分析，筛选两次重复数据进行t-test检验，p值小于0.05的蛋白，以及差异倍数(Fold change)1.2或0.83的差异蛋白进行功能注释和代谢通路分析；