[发明专利]一株生产阳离子型生物多糖絮凝剂的重组菌及其应用

权利要求书

1.重组菌，该重组菌以柠檬酸杆菌为出发菌株，引入编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因、引入编码磷酸核酮糖激酶的基因，敲除苹果酸合酶aceB基因，最后引入编码菌紫红质的基因。

2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID.1所示；所述编码磷酸核酮糖激酶的基因如SEQ ID.3所示；所述编码菌视紫红质的基因如SEQ ID.5所示；苹果酸合酶的基因如SEQ ID.7所述。

3.一种权利要求1或2所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步：CBB循环的搭建以及aceB基因的敲除：

1.1cbbM及prkA基因的克隆；

1.2通过PCR扩增aceB(GEN2534)上下游各500bp同源区；

1.3以pkd4质粒为模板，通过PCR扩增两端带有FRT位点的KanR抗性基因片段，作为重组克隆筛选标志；

1.4随后通过Gibson Assembly将片段连接将aceB上游同源臂、cbbM、ldh启动子、prkA、带有FRT位点的KanR抗性片段以及aceB下游同源臂，按顺序连接起来并利用高保真酶进行扩增，获得基因打靶片段；

1.5利用γ-Red系统，利用电转仪将打靶片段送入到带有pkd46质粒的柠檬酸杆菌感受态当中，孵育一段时间后筛选重组菌株；

第二步：菌紫红质的引入：

以Halobacterium salinarum菌的菌紫红质基因为模板，通过长片段合成经过密码子优化的菌紫红质基因片段；在经过PCR扩增后，通过over-lap PCR将其与柠檬酸杆菌ldh基因上下游各1000bp片段连接起来，并通过酶切连接，将该片段连接到pMMB67EH载体上；随后通过电转将该重组质粒转移到柠檬酸杆菌中，将经过抗性筛选以及PCR筛选到带有重组质粒的菌株转接到培养箱中筛选单交换菌株，筛选到发生单交换的菌株随后接种LB平板当中，筛选双交换菌株。

4.权利要求1或2所述的重组菌的在生产阳离子型生物多糖絮凝剂中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将重组菌接种到发酵培养基中，二氧化碳为必要碳源,发酵结束后处理得到阳离子型生物多糖絮凝剂。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵时碳源包括二氧化碳、脂肪酸、脂肪醇、单糖、寡糖等一种或者多种碳源，其中二氧化碳为主要碳源。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，培养条件如下：35-37℃，转速50-300rpm，pH用1M氢氧化钠溶液控制在7.0，接种量5％，发酵时间为30小时，培养方式为厌氧；所用发酵培养基成分如下：辛酸2g/L、蔗糖5g/L、酵母提取物10g/L、蛋白胨5g/L、氯化铵1g/L等，微量元素ZnSO₄·7H₂O 2.8g/L，H 3BO 9.4g/L，CuSO₄·5H₂O 5g/L，MnCl₂·4H₂O 4.6g/L)，二氧化碳通过0.22微米滤膜过滤由钢瓶通入发酵罐，维持发酵罐上空的二氧化碳压力在0.2Mpa。

8.一种阳离子型生物多糖絮凝剂，其特征在于，由权利要求1或2的重组菌发酵制备而成。