[发明专利]一种多功能磁性纳米微球及制备和应用

说明书

本发明涉及一种多功能磁性纳米微球及制备和应用，属于细菌分离和富集领域。本发明在氨基化磁性纳米微球(MNP_‑NH2)表面首先修饰聚多巴胺(PDA)壳层后，连接长链聚乙二醇(PEG)分子臂，然后在分子臂上修饰抗生素多粘菌素B(PMB)得到MNP_{PDA‑PEG‑PMB}。PMB具有广谱细菌结合特性，但对G^‑的结合能力更强。在MNP‑_NH2表面修饰PDA可提高MNP表面的活性基团数量，提高其所结合PMB的含量；长链PEG有助于减少MNP与细菌结合时的空间位阻，两者结合最终提高MNP_{PDA‑PEG‑PMB}的吸附容量。吸附了细菌的MNP_{PDA‑PEG‑PMB}微球，可直接加入固体和液体培养基中进行培养，快速检测细菌活性。MNP_{PDA‑PEG‑PMB}联合热裂法可应用于复杂样品中系列细菌核酸快速检测。

技术领域

本发明属于细菌分离和富集领域，更具体地，涉及一种高效靶向分离和富集细菌的多粘菌素B功能化磁性纳米微球及制备和应用。

背景技术

据世界卫生组织(WHO)统计，致病性细菌感染每年可能造成1330万人死亡，对全世界公共卫生安全构成极大威胁(Analyst,2012,137(15):3405-3421)。致病菌种类繁多，感染途径多样，治疗药物众多，建立病原菌快速、精确检测方法，有助于更好地预防并治疗细菌感染(Mater Chem B,2017,5(44):8631-8652)。病原菌检测包括活性检测和核酸检测两大方面。由于实际样品中的细菌含量不一，且其中的蛋白质、脂肪、酶反应抑制剂、离子等，均可影响细菌活性和核酸检测的灵敏度和准确性，往往需要从样本中分离富集靶细菌后，再进行活性和核酸检测，以保证检测的灵敏度、准确性和可靠性(Biosens andBioelectron,2011,26(11):4368-4374)。因此，开发简单快速方便，且可同时用于细菌活性和核酸快速检测的细菌分离富集材料和方法十分必要。

常用的病原菌富集方法主要包括选择性培养法、物理法和生物亲和法。细菌选择性培养富集仅针对特定细菌，通常需要2-4天时间，耗时长，无法实现快速检测；物理方法主要有离心、过滤、超滤等，需要仪器设备基础，且它们更适用于细菌种群筛查，若进行特定细菌富集则特异性不够。而生物亲和法是利用细菌和固相载体上亲和分子之间的亲和作用实现分离，是一种温和、高效、简单的细菌分离富集方法。其中，磁性纳米微球MNP(Magneticnanoparticle，MNP)具有超顺磁性，便于利用磁场进行分离操作，克服了其他纳米材料难以从样本基质中分离的问题。MNP具有高吸附容量，表面易于连接各种功能化基团，适合用于制备生物亲和材料。修饰MNP的识别分子中，抗体特异性强，但也有诸多缺点，如价格昂贵，所需孵育时间长，稳定性差等；生物大分子功能基团众多，在修饰过程中三维结构变性和随机分子取向可能使其生物活性下降；有机/无机分子通常为非特异性吸附，缺乏选择性。小分子抗生素对细菌具有选择性靶向作用，稳定性好，适合作为亲和分子。抗生素多粘菌素B(Polymyxin B，PMB)具有广谱细菌吸附性能。PMB侧链氨基与G^-外膜脂多糖脂质A的磷酸基团发生静电结合，同时第6、7位氨基酸和脂肪酰基侧链与脂质A的脂肪酸部分发生疏水相互作用，其对G^-的作用更强(见图1)，因此PMB在不同样本中对G^-和G⁺菌的特性有一定差异，但呈现较强的G^-靶向作用，价格便宜，适合用于制备样品预处理所用的功能化MNP。先前关于PMB的研究集中在抗菌领域(Sci Adv,2021,7(32)：eabj1577)，这限制了其在细菌吸附和细菌活性检测中的应用。此外，纳米颗粒间的空间位阻效应会降低细菌的吸附容量。因此，提高PMB功能化纳米微球的生物兼容性和降低其空间位阻效应是需要解决的难题。