[发明专利]一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种羊支原体肺炎平板凝集抗原，其特征在于，使用丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株制成，其中3种支原体菌体的灭活前浓度均为7.0×10¹⁰CCU/mL。

2.一种权利要求1所述的羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株分别接种于羊支原体培养基，传代后制成3种基础种子菌液；

(2)将3种基础种子液分别接种于羊支原体培养基中扩大培养，获得3种生产种子液；

(3)将3种生产种子液分别进行发酵培养，并对菌液进行CCU计数和无菌检验；

(4)在3种发酵培养菌液中分别加入含硫柳汞的PBS重悬灭活，按CCU计数结果调整菌液浓度，将3种重悬后的菌液按体积比1:1:1混合，加入结晶紫溶液染色和甘油制备得到羊支原体肺炎平板凝集抗原，混匀后分装保存。

3.根据权利要求2所述的羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)基础种子液的制备：取丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株冻干菌种，开启后，分别按10％的量接种羊支原体培养基，置37℃培养18～36h收获后作为一级基础种子，将一级种子液按10％比例再接种传代1次，收获分装后置-80℃冻存，作为二级基础种子；

(2)生产种子液的制备：取丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株的二级基础种子，按10％比例分别接种于生产用羊支原体培养基，置37℃恒温摇床，120rpm震荡培养18～36h至培养基变为黄色，扩大培养，获得生产种子液；

(3)发酵培养：采用生物反应器分别大规模培养丝状支原体山羊亚种SZ013株、山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株，先对生物反应器进行灭菌，无菌加入羊支原体培养基，按1:10的比例接种生产种子液，37℃恒温培养，严格控制不通气，待pH下降至6.9～7.0时，添加羊支原体培养基为原培养体积的20％，进行两次补料培养，待第二次培养pH下降到6.7～6.8时收获菌液，并对菌液进行CCU计数和无菌检验；

(4)抗原制备，在3种菌液中分别加入0.2～0.4％羟甲基纤维素钠，置2～8℃静置7～10日，8000rpm离心菌液20min，取沉淀用含0.01％硫柳汞的PBS重悬，按照CCU计数结果，调整菌液浓度为2.3×10¹¹CCU/mL，置37℃灭活3小时，将3种重悬后的菌液按体积比1:1:1混合，反复搅拌均匀后，加入3％结晶紫溶液至终浓度为0.03％，继续搅拌20分钟，加入10％菌液体积的甘油，继续搅拌10分钟，即得到羊支原体肺炎平板凝集抗原，分装后置2～8℃保存。

4.权利要求1所述的羊支原体肺炎平板凝集抗原在羊支原体肺炎感染检测中的应用。