[发明专利]一种银鲳肝脏细胞系及其应用

说明书

本发明提供一种银鲳肝脏细胞系及其应用，所提供的细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C202261。本发明的银鲳肝脏细胞系细胞性状优良，可连续传代，通过传代能够提供大量的银鲳肝脏细胞系；本发明的银鲳肝脏细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好。本发明的银鲳肝脏细胞系易感染虹彩病毒、高效表达外源基因，同时适用于脂多糖和棕榈酸对肝脏细胞产生影响的体外研究。

技术领域

本发明属于海水鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种银鲳肝脏细胞系及其应用。

背景技术

鱼类的细胞系被广泛认为是研究水产养殖包括鱼类生长、疾病、繁殖、遗传学和生物技术等许多关键问题的重要工具。自1962年建立第一个鱼类细胞系RTG-2以来，已经从不同类型的鱼类组织样本包括鳃、鳍、眼、肝和肾等建立了约880多个鱼类细胞株。基于肝脏在硬骨鱼类中的关键作用，首次分离肝脏细胞用于金鱼细胞中激素刺激的糖原分解研究；来自黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)肝脏的ALL细胞系用于研究对三种主要鱼类病毒敏感时先天免疫基因的表达；石斑鱼(Epinephelus awoara)的肝脏GL细胞系用于石斑鱼虹彩病毒的繁殖，并研究了从该细胞系分离的病毒特性。此外，对巨石斑鱼(Epinephelus tauvina)肝脏细胞系GL-av进行了基因修饰，以评估抗凋亡蛋白Bcl-xL的有效性；来源于虹鳟肝脏的RTH-149细胞系用于解读与鱼类营养相关的分子机制。简言之，大量研究表明肝脏细胞系是研究鱼类营养和代谢以及免疫调节基因的重要工具。

银鲳(Pampus argenteus)是一种高价值的海洋经济鱼类，广泛分布在东南亚和中东的沿海海域。由于银鲳适合在海洋网箱和室内水池中养殖，银鲳的人工繁育和养殖技术已经标准化。然而，由细菌性、病毒性或寄生虫等病原引起的病害日益频繁爆发，已成为了制约银鲳产业化的主要因素之一。因此，迫切需要具有稳定性状的体外细胞系工具来研究银鲳养殖过程中病原体逃逸宿主免疫反应的机制。

发明内容

本发明的目的是提供一种银鲳肝脏细胞系及其应用，所提供的细胞系能够用于研究银鲳养殖过程中病原体逃逸宿主免疫反应的机制。

本发明首先提供一种增殖快且稳定的银鲳肝脏细胞系PaL，于2022年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO:C202261。

本发明所提供的银鲳肝脏细胞系PaL的构建方法如下：

1)原代培养：无菌条件下获取银鲳幼鱼肝脏组织，置于添加双抗(青霉素和链霉素)的基础培养基中，用含1％双抗的无菌D-hanks漂洗和清理肝脏组织上的附着物，移入含细胞培养液的离心管中用剪刀剪成小块，离心后取上清，加入胰蛋白酶室温消化30分钟后加入等体积的完全培养基终止消化，而后全部转移到100目细胞筛过滤，滤液离心弃上清，加入完全培养基重悬细胞，最后将悬液转至培养瓶中于22±0.2℃培养箱正置培养；

2)传代培养：待原代培养组织块周围细胞迁出并增殖至形成单层细胞时，加入0.25％胰蛋白酶消化液使细胞悬起，而后利用完全培养基进行传代培养，待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1：1或1：2分瓶传代，之后3-4天传代一次。传至10代之后，传代所用0.25％胰蛋白酶替换为重组酶。

本发明所提供的银鲳肝脏细胞系PaL在研究银鲳养殖过程中病原体逃逸宿主免疫反应的机制中的用途；

所述的病原，作为实施例的一种具体记载，为虹彩病毒；

本发明所提供的银鲳肝脏细胞系PaL还用于研究脂多糖和棕榈酸对肝脏细胞的影响。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的银鲳肝脏细胞系细胞性状优良，可连续传代，通过传代能够提供大量的银鲳肝脏细胞系；

2、本发明的银鲳肝脏细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好；