[发明专利]一种基于Lpp引导序列靶向呈递和高效表达外源抗原的重组沙门菌构建方法

说明书

本发明公开一种基于Lpp引导序列靶向呈递和高效表达外源抗原的重组沙门菌构建方法，利用同源重组方法将大肠杆菌Lpp引导序列引入到本实验室前期构建的pS‑SaoA质粒中，形成重组表达质粒pS‑Lpp‑SaoA，在猪霍乱沙门菌载体菌株rSC0016中引入pS‑Lpp‑SaoA质粒，形成重组猪霍乱沙门菌rSC0016（pS‑Lpp‑SaoA）；外源抗原SaoA在该菌株及其OMVs中可以高效表达和靶向呈递，免疫小鼠后可产生强大的体液免疫和细胞免疫，并产生高水平的细胞因子，保护小鼠免受猪链球菌致死剂量的攻击；本发明为无佐剂OMVs疫苗平台提供了一种有前景的通用策略，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体通过质粒改造引入Lpp引导序列以提高沙门菌中外源抗原表达水平和免疫原性的一种构建方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病原体，是猪链球菌病的主要病原。它能够导致多种疾病包括脑膜炎、关节炎和败血症等，不仅给养猪生产业造成巨大的经济损失，也给相关从业人员的健康造成了巨大的威胁。根据其荚膜多糖不同可分为33种血清型。猪链球菌2型是临床分离率最高和致病力最强的血清型，猪链球菌9型和7型在世界范围内也引起广泛关注。SaoA蛋白几乎在所有猪链球菌血清型中均有分布的高度保守具有免疫原性的抗原蛋白。我们的前期研究证实递送猪链球菌SaoA蛋白的重组减毒猪霍乱沙门菌可有效保护小鼠免受猪链球菌多种血清型的感染。细菌感染仍然是导致人类和动物死亡的主要原因之一。由于耐药菌的增加和快速传播，抗生素治疗细菌性疾病的有效性受到了挑战。因此，疫苗被认为是后抗生素时代应对细菌性疾病最直接有效的策略。目前针对细菌的商品化疫苗主要包括亚单位疫苗、灭活苗和弱毒苗。这些疫苗目前都存在着一定的不足。亚单位疫苗的成本相对较高且交叉保护效果不够理想；灭活苗会使其丢失大部分抗原表位、免疫保护持续时间短，保护性不足；弱毒苗具有毒力返强的风险，存在很大的安全隐患。细菌性疾病亚单位疫苗由于其生产工艺简单、成本低及安全性高等优势，成为细菌疫苗的重要发展方向。此类疫苗主要由原核表达系统(如大肠杆菌)大规模生产，表达产物通常无法进行正确的加工和折叠，影响表达蛋白的构象导致免疫原性较差。除了安全性外，评价一个疫苗的另一个重要指标就是其免疫原性。因此如何提高细菌性疾病亚单位疫苗的免疫原性成为首要解决的问题。

与传统疫苗相比，OMVs作为细菌疫苗存在着诸多优势：(1)免疫原性好：OMVs为典型的纳米颗粒结构，有利于进入淋巴管并被抗原递呈细胞高效摄取，另外OMVs包含大量天然构象的外膜抗原，可有效刺激机体的体液和细胞免疫反应；(2)有效的天然佐剂：OMVs含有LPS可作为佐剂，可诱导宿主产生高效的免疫应答；(3)靶向改造：OMVs可通过基因工程手段被定向改造，将目标抗原包裹入囊泡腔内或者镶嵌至外膜上，然后递呈至宿主细胞。大量研究证明OMVs无论是作为病原菌自身疫苗还是作为疫苗递呈载体构建重组二联疫苗均具有非常大的应用潜力。

外源抗原在菌体和OMVs中的表达量和表达位置是影响疫苗保护效力的关键因素。作为载体所递送的外源抗原表达量低，会导致诱导针对外源病原的免疫保护效力不足。因此，外源抗原表达量低是诱导高免疫保护效力和疫苗生产一线的大忌。原则上，外源抗原表达在菌体和OMVs表面是诱导抗原特异性免疫应答的最佳策略，可以增强抗原与B细胞受体的结合。然而，抗原靶向表达在菌体和OMVs表面仍然具有一定的挑战性，通常需要外源抗原和细菌外膜蛋白的嵌合表达模式。相对而言，外源抗原表达在菌体和OMVs内腔中则相对容易。

研究已经证实，细菌可以通过脂蛋白转运途径将脂蛋白转运至菌体的表面，进而呈递到OMVs的外膜。可利用基因工程手段将外源抗原与脂蛋白引导序列融合表达，以脂蛋白转运机制为理论基础创建OMVs呈递系统，构建OMVs递送外源抗原的二联疫苗。因此Lpp引导目的抗原靶向表达在OMVs膜表面的功能对于提高疫苗株OMVs表达外源抗原具有重要应用潜力。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于Lpp引导序列靶向呈递和高效表达外源抗原的重组沙门菌构建方法。