[发明专利]一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法

权利要求书

1.一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)闽楠种子预处理：

将成熟的闽楠果实收获后，去掉果皮，将种子清洗干净，阳光下晾晒至表面无水分附着，然后将种子低温沙藏处理；

(2)播种与育苗：

将低温沙藏处理的种子播于湿沙中发芽生长至1-3片叶，得到所需闽楠幼苗；其中闽楠育苗阶段发芽后采用温度26℃/22℃(昼/夜)，光照16h/黑暗8h，光照强度为30-50μmol·m^-2·s^-1，覆盖保鲜膜保湿，湿度为70％-85％；

(3)侵染：

用发根农杆菌对闽楠幼苗进行侵染，侵染后把幼苗移栽入已充分吸水的基质中，侵染部位被基质覆盖；其中侵染菌液浓度OD₆₀₀为0.4-1.2，发根农杆菌菌种为K599,C58C1或MSU440；

(4)共培养

将上述侵染后闽楠幼苗黑暗条件下共培养1-3天；共培养条件是26℃/22℃(昼/夜)，并加盖保湿透明塑料罩进行全程保湿，湿度为70％-85％；

(5)毛状根诱导培养，获得转化成功的阳性闽楠植株：

将共培养后的闽楠幼苗进行毛状根的诱导培养，诱导培养的条件是：温度26℃/22℃(昼/夜)，光照16h/黑暗8h，光照强度为30-50μmol·m^-2·s^-1；诱导期间全程保湿，湿度为70％-85％；培养一周后，打开罩子的通气孔；开始毛状根诱导时，每周浇灌促根营养液一次，浇灌三周，所述促根营养液为在1/4Hoagland营养液内添加NAA，使得NAA终浓度为0.05-0.1mg/L；

(6)复合型转基因植株培养。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(1)中所述沙藏处理方式为：将种子与湿度为40％-60％的干净湿河沙按重量比1:4-1:5混合均匀装入网纱袋，放入带盖泡沫箱，盖好盖子并用保鲜膜封好，4℃冰箱冷藏；每两周打开泡沫箱检查河沙湿度，喷壶喷洒适量水进行保湿，保持湿度与干净湿河沙初始湿度一致。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(2)中湿沙为湿度60％-70％的河沙，播种深度为0.5-1.5cm。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于步骤(2)中播种深度为1cm。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(2)中用于侵染的幼苗生长至展开2-3片叶。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(3)中侵染方式为注射或针刺后浸泡抽气；侵染部位为种子上方0-1cm的茎部，注射位置3-5处。

7.根据权利要求1或6所述方法，其特征在于步骤(3)中侵染菌液浓度OD₆₀₀为0.8-1.2，发根农杆菌菌种为K599。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(3)中基质为泥炭土、珍珠岩、蛭石，按照体积比2：1：1混合而成，其中泥炭土的粒径为1-10mm，珍珠岩的粒径为3-6mm，蛭石的粒径为1-3mm。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(6)具体是将含转基因根的阳性植株转移到1/4Hoagland营养液进行水培培养，或在基质中继续培养，培养条件：湿度70％-85％，光照16h/黑暗8h,温度26℃/22℃(昼/夜)；待转基因根系发育充分后可去除植株的非转基因根，得到复合型转基因植株。