[发明专利]一种基于多重连接探针扩增技术对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲进行检测的方法

权利要求书

1.一种基于多重连接探针扩增技术对石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)以提取的基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲的核基因片段；

3)将扩增产物变性后与MLPA探针杂交；

4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；

5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；

6)收集熔解曲线信号，观测Tm值，

其中，所述MLPA探针共3组，每一组分别由左探针和右探针组成，其中：

第一组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGGGTCCGGTCGCGGCACGGCATGCGGTGGG；右探针：CTGAGAGAAAGAGTCCCTACCACTCGCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC；

第二组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTGATCGCGGCACGGCATGCGGTGGC；右探针：CTGAGAGAAAGAGTCCCTACCACTCGCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC；

第三组左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTCAGAATTGTATACTCATCCCCCAAAGACGAAA；右探针：TGACGCGCACGCCTCGCCGCTCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述石菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述水菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、所述九节菖蒲核基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，用于扩增所述石菖蒲、水菖蒲、九节菖蒲核基因片段的特异性引物序列如下；

上游引物:CGAGGGCACGCCTGCCT

下游引物:GACGCTTCTCCAGACTACAAT。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述通用引物序列如下：

上游引物:GGGTTCCCTAAGGGTTGGA

下游引物:TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述DNA连接酶为9°N DNA Ligase。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)中所述杂交的温度是70℃，时间20min。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤5)中所述实时荧光定量PCR扩增的反应循环数是36循环。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤6)中，通过观测样品熔解曲线峰和Tm值判断结果，若样品出现单一熔解曲线峰并且Tm值为84.32℃±0.07℃，则为石菖蒲；若样品出现单一熔解曲线峰且Tm值为86.03℃±0.06℃，则为水菖蒲；若样品出现单一熔解曲线峰且Tm值为82.53℃±0.05℃，则为九节菖蒲；若样品出现两个或三个相应Tm值的熔解曲线峰，则为两种或三种菖蒲的混合样品。