[发明专利]一种基于数字微流控技术的单细菌基因组测序方法

权利要求书

1.数字微流控芯片，其特征在于，包括细菌捕获及裂解单元、液滴生成通道、储液池单元和电极接口；所述储液池单元的数量不低于5个，分别存储有裂解试剂A、裂解试剂B、中和液、扩增试剂和菌液；其中，

裂解试剂A包括：800～2400U/μL溶菌酶、400～1200mM二硫苏糖醇和2～6mM乙二胺四乙酸；

裂解试剂B包括：300～500mM KOH、80～120mM二硫苏糖醇和5～15mM乙二胺四乙酸；

中和液包括：0.8～1.2M Tris-HCl溶液；

扩增试剂包括：随机引物、DNA聚合酶、dNTP、扩增缓冲液和二硫苏糖醇。

2.根据权利要求1所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述扩增试剂中的DNA聚合酶包括：vent DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、DNA聚合酶I、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Equiphi29 DNA聚合酶中的任意一种或两种以上的组合。

3.根据权利要求1或2所述的数字微流控芯片，其特征在于，还包括荧光染料、填充油和纯化试剂；

所述荧光染料选自PI、DAPI，SYTO-9,FM 1-43FX,FM 4-64,FM 4-64FX,BacLighBacterial Stains,Alexa Fluor 647NHS Ester,CellTracker^TM红色CMTPX或FM 1-43；

所述填充油选自矿物油、氟油、硅烷油、二甲基硅油；

所述纯化试剂选自柱纯化试剂或磁珠纯化试剂。

4.根据权利要求1～3任一项所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述的裂解试剂A、裂解试剂B、中和液的体积比为1:(1～1.5):(1～1.5)；所述扩增试剂与裂解试剂A、裂解试剂B和中和液的混合液的体积比为1:6.5。

5.根据权利要求1所述的数字微流控芯片，所述细菌捕获及裂解单元包括：上极板基底，设置在所述上极板基底下表面的ITO涂层，设置于所述ITO涂层下表面的上疏水层；下极板基底，设置于所述下极板基底上表面的介质层，嵌设于所述介质层内的电极，设置在所述介质层上表面的下疏水层，支撑于所述下疏水层和所述上疏水层之间的支撑体，所述上疏水层、所述下疏水层和所述支撑体之间形成液滴生成通道，所述下疏水层嵌设有亲水凹槽，所述亲水凹槽的上槽口与所述液滴生成通道相通；所述液滴生成通道的通口与所储液池单元连通；所述电极接口与所述电极相连接。

6.根据权利要求5所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述亲水凹槽为中空的圆柱形结构，直径为150～300μm，与每个储液池皆有2个电极以上的距离。

7.根据权利要求5所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述的储液池尺寸为1mm×1mm，所述储液池直径与通道直径的比例为(5～8)：1。

8.数字微流控装置，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的数字微流控芯片、集成电路和成像系统；所述的集成电路与数字微流控芯片的电极接口相连。

9.单细菌基因组测序的方法，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的数字微流控芯片，和/或权利要求8所述的数字微流控装置进行单细菌的分离捕获、核酸扩增、文库构建和基因组测序。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，具体包括：

菌液经染色后，置于数字微流控芯片的储液池中，以填充油封闭芯片后，集成电路控制电极通断电，使菌液通过液滴生成通道移动至亲水凹槽，分离捕获单个细菌；

控制电极通断电，依次使裂解试剂A、裂解试剂B、中和液和扩增试剂通过液滴生成通道进入亲水凹槽，然后进行扩增；

将扩增产物经纯化、文库构建后，进行测序。