[发明专利]一种抗PCNA重组抗体的重/轻链可变区编码基因及其重组抗体和应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及一种抗PCNA重组抗体的重/轻链可变区编码基因以及重组抗体和应用。本发明的抗PCNA重组抗体包括重链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1和轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3。本发明抗PCNA重组抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于多次免疫及筛选得到的一株高特异性的抗PCNA的单克隆株，特异性强，稳定性好，将该抗PCNA重组抗体应用于检测试剂盒产品中，将各序列的优势通过抗体的优势来体现，更加适用于病理诊断，具有重要的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及一种抗PCNA重组抗体的重/轻链可变区编码基因以及重组抗体和应用。

背景技术

增殖细胞核抗原(PCNA)是真核细胞DNA合成所必需的一种36KD的核蛋白，它在G1期PCNA的表达逐渐增加，s期达最高峰，而G2/M期则减少。PCNA的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记，也成为肿瘤细胞失调状态下的一个标记，检测PCNA可以客观评价肿瘤细胞增殖状态。

PCNA无种属及组织特异性，其小鼠单克降抗体可以适用于冷冻组织、石蜡切片及培养的细胞等多种材料以及ELISA、Western blot、免疫组织化学等多种实验技术，同时可以与大鼠、小鼠、猴、人、昆虫、猫、狗等多个种属发反应，在基础科研中应用非常广泛，也是日常病理诊断中检测肿瘤增殖状态的一个常用标记分子。有研究表明PCNA能较好地反映细胞的增殖活性，也有研究显示PCNA与某些肿瘤的预后及诊断有一定关系。在乳腺癌的预后研究中，Ki67与PCNA这类增殖标记与p53等一同被列为仅次于雌激素受体、组织学级别的乳腺癌第二类预后指标。此外，PCNA在其他肿瘤如肺癌、胃癌等其他组织来源肿瘤的良恶性的区分、恶性程度的确定及评估预后等方面有较广泛的应用。

传统用于病理诊断的抗体，主要是利用传统的小鼠杂交瘤技术制备生产，生产方式为首先制备抗原免疫小鼠，然后获取小鼠的脾细胞并与特殊的骨髓瘤细胞融合，使其变成“永生化”的杂交瘤细胞，最后通过杂交瘤细胞的培养源源不断的产生抗体。其主要弊端在于制备周期较长、表位丢失严重、单克隆细胞株传代过程中的抗体染色体丢失、细胞复苏后污染等问题，因此并不能达到真正意义上的永生。此外由于制备过程依赖动物，不仅无法克服动物个体差异性带来的批间差，而且随着人类对动物保护的认识加强，对于动物的限制使用也将是大势所趋。而用于临床病理诊断的抗体要求抗体具有较高的稳定性和一致性，因此，必须寻找稳定性良好且不依赖动物的抗体制备技术，基因工程抗体技术即重组抗体技术的产生解决了以上难题。

新一代重组抗体技术与传统杂交瘤技术相比有着明显优势，一是可根本防止杂交瘤细胞在传代过程中抗体基因容易丢失以及细胞株容易污染的缺陷，而重组抗体技术可以对抗体基因进行解码，使得抗体基因可以像芯片一样永久保存；其二，重组抗体可以从根本上摆脱动物依赖性，从而防止了因动物批次差异导致的批间差异，保证了产品的“稳定性及一致性”，特别适用于大剂量单抗的工业化使用；第三，重组抗体的开发使得单克隆抗体不再局限于小鼠，由于某些物种暂时未能获得工业化的骨髓瘤细胞，使得该物种的单抗制备受限，而利用重组抗体的技术理论上可以获得任何物种的单克隆抗体，从而打破市场上小鼠单抗独占鳌头的局面；此外，由于重组抗体主要是利用哺乳动物细胞进行表达，而哺乳动物细胞可实现反应器的大规模培养，培养规模可高达5000L，产量可达10g/L，对于需求量比较大的抗体(如IVD抗体以及抗体药物)，采用基因工程抗体大规模表达，它具有极大的成本效益，一次开发，终身受益。

目前临床病理诊断用的抗PCNA小鼠单抗，主要采用的是传统杂交瘤技术制备方法获得，无法克服由于动物个体差异引入的批间差，且单批次产量小，且无法避免优质的单克隆株丢失的问题，使得在病理诊断的过程中出现一定的偏差和误诊。此外，与科研用抗体的研发有所不同的是，研制出适用于临床病理诊断用的PCNA抗体需要考虑诸多因素，包括抗体的特异性、稳定性、产量、一致性、以及抗体功能实用性等因素。因此，开发稳定可靠的重组抗体是非常具有市场前景的和意义。

发明内容