[发明专利]一种用于检测肠球菌以及耐药基因的数字PCR试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于检测屎肠球菌、粪肠球菌以及恶唑烷烔类耐药基因的数字PCR试剂盒。通过数字PCR检测方法基于荧光探针法针对靶基因设计特异性引物探针检测两种肠球菌及耐药基因。本发明的方法灵敏度高解决了样品中是否含有屎肠、粪肠菌DNA并且区分是否含恶唑烷烔类耐药基因在基因检测领域具有广泛的用途。

技术领域

本发明涉及基因检测领域尤其涉及一种用于检测屎肠球菌、粪肠球菌以及恶唑烷烔类耐药基因的数字PCR试剂盒。

背景技术

肠球菌属细菌是寄居于人体和动物肠道内的正常菌群异位寄生可致尿路感染、呼吸道感染、伤口感染、心内膜炎、脑膜炎和败血症等。近20年来肠球菌已成为日益增加的医院感染的重要病原菌在临床分离的革兰阳性球菌中肠球菌属仅次于葡萄球菌属而居第2位。随着抗菌药物的广泛应用、各种侵袭性医用装置的使用以及免疫缺陷人群的增加肠球菌所致感染逐渐增多大部分为医疗相关性感染包括血流感染、手术部位感染、尿路感染及腹腔感染等。

恶唑烷酮类抗菌药物是继磺胺类和氟喹诺酮类后上市的又一类全合成抗菌药。利奈唑胺 (linezolid)为该类药物中的首个上市产品，本品在临床革兰阳性菌感染的治疗中疗效显著，尤其是对耐药菌的作用成为其一大亮点尽管如此，利奈唑胺同样也很难避免耐药性问题。

肠球菌可以通过改变作用靶点来实现对利奈唑胺的耐药。23S基因改变的程度和MIC 增长的程度成比例。利奈唑胺耐药株比例不高小于1％。优先使用利奈唑胺和β内酰胺药物、血液科病房治疗等被认为是利奈唑胺耐药的危险因素。利奈唑胺目前仍是肠球菌引起血流感染(BSI)的强有力治疗方案即便病原株对达托霉素耐药。

而广泛存在于动物源和人源细菌质粒上的基因cfr，可同时介导五类化学结构不相关抗菌药物包括利奈唑胺的耐药。尽管恶唑烷酮类药可有效地治疗cfr阳性菌株引起的感染，但是新型耐药基因optrA可对包括泰地唑利在内的恶唑烷酮类及酰胺醇类药物耐药。目前，有许多报道显示了cfr基因在革兰阳性菌和optrA基因在肠球菌中的流行传播情况。poxtA 基因是2018年在利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌中发现的可以介导利奈唑胺耐药的基因。该基因大小为1629bp，其编码的542个氨基酸属于ABC转运蛋白家族。poxtA基因除了介导利奈唑胺等恶唑烷酮类抗菌药物耐药，还可介导苯丙醇类、四环素类耐药，该基因主要位于质粒，可以水平传播。

发明内容

本发明基于荧光探针法针对靶基因设计特异性引物探针检测两种肠球菌及恶唑烷烔类耐药基因。

本发明提供了一种用于检测屎肠球菌、粪肠球菌以及恶唑烷烔类耐药基因的核酸组合其特征在于：

检测屎肠球菌的探针序列recA-P为5’-R1-ATTCTACGCAACGATCC-Q1-3’；

检测粪肠球菌的探针序列ClpX-P为5’-R2-TGAACGTGGGTTGGATGA-Q2-3’；

检测恶唑烷烔类耐药基因的探针序列：

Cfr-P为5’-R3-TCTAGCCAACCGTCAAG-Q3-3’；

optrA-P为5’-R4-TTAAGTGCTTCAGAACTTGT-Q4-3’；

poxtA-P为5’-R5-CATCACCTCAAACGAAT-Q5-3’；

内参探针IC-P序列为5’-R6-AGTTTGCGACATCTC-Q6-3’；

所述的R1-R6为荧光报告基团Q1-Q6为荧光淬灭基团。

优选的R1-R6选自FAM、VIC、ROX、Cy5、A425或Cy5.5；Q1-Q6选自MGB、BHQ1 或BHQ2。

根据上述的核酸组合，其特征在于，相应的核酸探针的引物和内参探针的引物为：