[发明专利]用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的引物组合和扩增子靶向测序方法

说明书

本发明公开了一种用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的引物组合，包括上游引物F1：5’‑GAACGACATGGCTACGATCCGACTT SPECIAL F‑3’；下游引物R1：5’‑CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT SPECIAL R‑3’，其中SPECIAL F包括序列表中的序列1‑64中的单数序列，SPECIAL R包括序列表中的序列1‑64中的双数序列。本发明的目的在于提供一种病原微生物扩增子靶向捕获测序技术，旨在对临床标本进行选择性消耗人类DNA后，实现低起始量微生物基因组的富集，简单有效的提升病原微生物病原检出率，与此同时提高其耐药基因检出率。

技术领域

本发明涉及用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的引物组合和扩增子靶向测序方法。

背景技术

耐药是指病原微生物对临床关键药物敏感性减弱或丧失。细菌耐药基因检测在临床诊断中具有重要意义。随着抗菌药物在人医、兽医领域的广泛应用，细菌耐药情况愈演愈烈，因而也对细菌耐药性检测手段提出了更高的要求。细菌药物敏感性实验是细菌耐药性检测最经典的方法，尤其稀释法是细菌耐药性检测的金标准，可获得精确的MIC值、灵活性强，是临床和实验室研究最为常用的细菌耐药性检测方法；商品化自动分析系统的推广应用，相比稀释法大大缩短了实验周期，特别适用于临床细菌耐药性检测。但无论是经典的稀释法亦或是自动分析系统，由于其均需要获得分离自样本的细菌纯培养物且耗时长，难以在抗感染治疗快速应对上发挥作用。

随着检测技术的发展以及对细菌耐药性的更深入认识，更多的研究将目光投向与耐药基因产生和传播密切相关的耐药基因、元件的PCR及qPCR检测技术，这类技术可快速、准确地探知耐药基因、元件，从而及时确定感染细菌的药物敏感性，为临床抗感染治疗提供更加及时的依据，也逐渐成为临床和实验室耐药细菌检测、监测的重要手段，但该类技术只能用于已知目的基因的筛查，不能胜任大规模、高通量细菌耐药性的检测和监测工作。

现阶段应用较广的商业化细菌耐药基因检测方法主要包括以下四种：自动检测系统的Vitek2，飞行质谱MALDI-TOF，快速的生化检测以及实时影像监测。Vitek2进行临床样本检测时表现出较好的一致性，但是其检测样本需为阳性培养物，而一般血液样本报告阳性时间需要至少24小时，极大延误了治疗时机。实时影像监测也存在相同问题。飞行质谱以及生化检测只能确定产碳青霉烯酶以及β内酰胺酶的病原体，对于其他耐药性的细菌很难进行准确检测。除此之外，以聚合酶链式反应为基础的细菌耐药性检测方法也应用较广，如Prove it，FilmArray，Verigene等，但是这些方法只能检测几种常见的耐药基因，存在一定局限性。

全基因组测序技术、MALDI-TOF MS以及微流控技术的发展为细菌耐药性检测提供了新思路。全基因组测序技术能够发现尽可能多的耐药机制，是细菌耐药机制研究的重要手段，但不适合临床和耐药性检测、监测中的推广应用；MALDI-TOF MS技术检测细菌耐药情况速度快、通量高，但由于其检测细菌耐药原理的限制，目前仅应用于有限几类细菌耐药性的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的引物组合。

本发明采取的技术方案为：一种用于6种病原微生物及其20种耐药基因检测的引物组合，包括

上游引物F1：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT SPECIAL F-3’；

下游引物R1：5’-CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT SPECIAL R-3’，其中SPECIAL F包括序列表中的Seq_1～-Seq_64中的单数序列，SPECIAL R包括序列表中的Seq_1～-Seq_64中的双数序列。

本发明的6种病原微生物包括肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肠道沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。耐药基因包括：耐β-内酰胺酶类5种的耐药基因型、耐碳青霉烯类14种的耐药基因型和耐甲氧西林类1种的耐药基因型。