[发明专利]柯萨奇病毒A组5型驯化株及其分离方法与应用

说明书

本发明提供一种柯萨奇病毒A组5型驯化株及其分离方法与应用。柯萨奇病毒A组5型驯化株为细胞生长表型为RD+/Vero+，保藏编号为CCTCCNo:V202234，通过全基因序列测定和比对，发现影响CV‑A5毒株在Vero细胞中增殖的相关核苷酸及氨基酸位点。此驯化株为Vero细胞适应株，可以为CV‑A5相关细胞嗜性、细胞生长特性、致病机理研究、基因定向改造及疫苗研发中动物模型建立、免疫原性研究以及抗病毒药物的筛选提供研究基础。

技术领域

本发明涉及病毒学技术领域，具体涉及一种高滴度柯萨奇病毒A组5型(CV-A5)驯化株及其分离方法与应用。

背景技术

手足口病(Hand、foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒血清型引起的法定丙类传染性疾病，引起HFMD的肠道病毒至少有20多个型，包括柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A，CV-A)2、4、5、6、10、12和16型，柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B、CV-B)的5型，埃可病毒(Enteric cytopatho-genichuman orphan virus，Echo)以及肠道病毒71型(Enterovirus71，EV-71)。

HFMD多发于5岁以下儿童。目前研究：表明EV-71是引起手足口病重症和死亡率的主要病原体，而CV-A和CV-B组中其它多种肠道病毒血清型也是引起HFMD爆发和散发的主要病原体。

CV-A5病毒衣壳由四种结构蛋白(VP4，VP2，VP3，VP1)组成。结构蛋白含有与细胞受体KREMEN识别结合的表位，结构蛋白区域氨基酸的改变可影响相应结构蛋白构象及功能，由此影响病毒与细胞表面受体和细胞侵入辅助因子的识别、结合、进而影响病毒感染能力及组织和细胞嗜性。结构蛋白VP1，VP2，VP3含中和抗原表位，能诱导机体产生抗病毒的中和抗体。此外，非结构蛋白编码区编码的蛋白及基因组核苷酸序列或非编码区5’-UTR以及3’-UTR的核苷酸序列与病毒RNA复制、转录、翻译、病毒组装与释放密切相关，非结构蛋白核苷酸和氨基酸序列的变化可影响相关酶的功能和活性、病毒RNA复制、病毒装配、继而影响病毒的细胞嗜性、生物学特性。

CV-A5可在RD细胞增殖并产生细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，却难以直接在人胚肺二倍体细胞(2BS)、Vero细胞、人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、犬肾细胞(MDCK)等人用疫苗细胞基质中分离，增殖并产生CPE，这使得针对CV-A5的基础研究及单价或含CV-A5的多价手足口病全病毒灭活疫苗，减毒活疫苗的研发难度增大。手足口病的流行和爆发严重影响婴幼儿的日常生活并存在潜在威胁，包括CV-A5在内的多种肠道病毒共流行造成巨大的疾病负担和经济负担。而研发及目标人群接种单价或多价病毒疫苗，建立人群免疫屏障，是切断病毒的传播较为有效的预防措施之一。疫苗的接种是控制传染病的较为经济的一种方式。目前尚无CV-A5单价或含CV-A5的多价疫苗临床研究的报道，而研究的受阻存在于CV-A5在人用疫苗细胞基质上分离率极低。研究CV-A5在Vero细胞及其它人用疫苗细胞基质中增殖的核苷酸或氨基酸位点，研究具有不同细胞嗜性毒株或驯化株的生物学性状、基因表达差异，有利于研究CV-A5感染Vero细胞的机制，亦有利于研发针对CV-A5的单价或含CV-A5的多价手足口病全病毒灭活疫苗及定向改造获得疫苗可用的病毒株。

发明内容

基于此，有必要提供一种高滴度柯萨奇病毒A组5型(CV-A5)驯化株及其分离方法与应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种高滴度柯萨奇病毒A组5型(CV-A5)驯化株，细胞生长表型为RD+/Vero+，其储存编号为CV-A5-3487V1/XY/CHN/2017。该CV-A5驯化株在2022年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:V202234，保藏地址为武汉大学。

CV-A5驯化株的病毒滴度为：1×10^6.5CCID₅₀/mL。