[发明专利]一种羊肚菌菌丝体的交配型分离方法

说明书

本发明涉及羊肚菌菌丝体的交配型分离方法，可有效解决羊肚菌菌丝体的交配型如何分离的问题，其解决的技术方案是，包括以下步骤:1）制备羊肚菌菌丝体的原生质体；2）制备羊肚菌交配型的DNA模板；3）扩增羊肚菌交配型的DNA模板；4）羊肚菌交配型的琼脂糖凝胶电泳分离；本发明分离方法由原生质体分离得到的单交配型的六妹羊肚菌，在扩大培养过程中，交配型基因是稳定的，不易退化的，液体培养法制备的原生质体更有活力，更有利于后续的遗传育种研究工作，是羊肚菌菌丝体的交配型的分离方法上的创新。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种羊肚菌菌丝体的交配型分离方法。

背景技术

羊肚菌(Morchella)是一种珍稀食药用菌，它富含氨基酸、多糖、矿质元素等多种营养成分和抗肿瘤、抗菌、保护心血管、增强免疫力等功效成分，广受世界各国人民喜爱。近年来，羊肚菌人工栽培技术取得重要进展，在“外营养袋”栽培模式引领下，易出菇羊肚菌品种如梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、六妹羊肚菌(Morchella sextelata)和七妹羊肚菌 (Morchella eximia)的商业化栽培迅猛发展，栽培面积已超过8000公顷且仍在不断增加。大量研究表明，羊肚菌是一种单极性异宗结合子囊菌，每个菌丝细胞含有15～42个细胞核(其子囊孢子也为含有 18～32个细胞核的多核细胞)，每个细胞核只有一个交配型，不同交配型的细胞核在菌丝细胞内共存呈异核状态；然而，两种交配型的细胞核在菌丝细胞中的分布是随机的，因此造成在羊肚菌的无性扩繁过程中常常发生一种交配型丢失的现象，这种现象被认为是羊肚菌菌种不稳定、老化退化和我国羊肚菌栽培低产或绝收的关键。

在食药用菌遗传育种研究中，以单核细胞或单套基因组遗传背景的单倍体实验材料为研究对象可以有效缩短研究周期、减少筛选遗传标记、杂交工作量，对阐释其背后的遗传机理十分有利。为此，科技工作者尝试了从子实体或子囊果组织分离、单孢显微分离、原生质体单核化以及幼嫩菌丝尖端切割分离等方法来获取单倍体实验材料并取得了许多进展；在利用原生质体技术分离交配型及单核体的差异分析研究方面，担子菌类食药用菌的研究较多，如潘迎杰、谭琦、朱朝辉、潘越、马丽娟、王波、张琪等应用原生质体单核化技术分别分离到香菇(Lentinus edodes)、大球盖菇(Stropharia rugoso-annulata)、斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)、金针菇(Flarnmulina velutipes)、猴头(Hericium erinaceus)等不同食药用菌的单交配型菌株，并开展了不同程度的再生单交配型单核体的遗传、生理生化等方面的差异性分析、诱变和杂交育种等研究；而子囊菌利用原生质体技术进行交配型分离的研究报道十分稀少。

传统的羊肚菌单交配型菌丝体的获取多采用子囊果组织分离或毛细管单孢分离显微操作的方法；如刘伟等采用组织分离法从多个羊肚菌子囊果中分离到单一交配型的同核体菌株，并发现其子囊果组织中存在交配型缺失现象(交配型缺失比例达43.96％)。刘萍等采取毛细管单孢分离法从多种羊肚菌子囊果中分离到子囊孢子单交配型及双交配型单孢菌株，并通过单孢菌株对峙培养实验发现羊肚菌中存在性亲和但营养体不亲和的现象。

现在一般认为：只有含有两个交配型的双交配型(或双极性)菌种才能作为生产使用，以保证菌种的稳定性和规模栽培高产稳产。另一方面，原生质体单核化技术、PCR技术的发展使得单细胞核或单交配型的细胞分离和鉴定成为可能；然而目前还没有采用原生质体单核化技术进行羊肚菌交配型(mating type，MAT)的分离和鉴定的研究报道。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种羊肚菌菌丝体的交配型分离方法，可有效解决羊肚菌菌丝体的交配型如何分离的问题。

本发明解决的技术方案是，该分离方法包括以下步骤:

1)制备羊肚菌菌丝体的原生质体