[发明专利]用于快速检测非洲猪瘟病毒的RPA扩增与测流层析免疫试纸条相结合的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于快速检测非洲猪瘟病毒的RPA扩增与测流层析免疫试纸条相结合的试剂盒。该试剂盒包含用于检测非洲猪瘟病毒的引物以及探针，其中所述的引物由上游引物和下游引物组成，该试剂盒中还包含用于检测非洲猪瘟病毒的扩增混合酶，该混合酶中含有UNG酶。与现有技术相比，本发明为ASFV的分子诊断提供了一个快速、简便、准确的检测试剂，特别是具有对仪器设备要求低，只需要一个恒温水浴锅或者恒温装置，检测速度快，约30min即可，不仅适用于科研单位定量分析，而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的RPA 实时荧光 RT-PCR（重组聚合酶实时定量聚合酶链反应）与测流层析免疫试纸条相结合的试剂盒。

背景技术

目前病毒核酸检测的主要方法为PCR法，常规的PCR检测需要特殊的热循环仪以及繁琐的试验程序，难以满足现场或田间条件下的检测需要。近年来，一些核酸等温扩增技术逐渐发展起来，这些技术不需要昂贵的PCR仪，并且可以在短时间内快速大量扩增出目的片段，具有简单、快速、灵敏度高等优点。其中的RPA技术更是被称为可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。RPA技术是模拟了生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来。它可以在非常短的时间内使目的基因以指数级增长，若配合荧光标记的探针和荧光信号检测仪便可实现对模板扩增的实时监测。目前关于将试纸条与重组酶恒温扩增结合起来检测非洲猪瘟病毒的方法未见报道。

申请公布号为CN 114703177 A的发明专利申请，公开了一种RPA等温扩增和免疫层析技术相结合的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒，该发明专利申请发明针对PRV的gE基因，通过筛选获得一组具有很高RPA扩增效率的引物探针，进一步结合免疫层析技术建立了胶体金试纸条RPA检测方法，实现了PRV感染的临床快速检测。同时样品通过高温处理即可实现核酸模板的制备，极大降低整个检测成本，缩短检测时间。

发明内容

本发明建立并优化出一种简捷、廉价、敏感的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测非洲猪瘟病毒（Infection with African swine fever virus，ASFV）的试剂盒及利用该试剂盒检测非洲猪瘟病毒核酸的方法。RPA技术大大减少了检测时间，简化了反应程序，结合便携式的实时荧光检测设备与侧向流胶体金试纸条，使其适用于现场或田间检测，具有广阔的应用前景。利用RPA技术与免疫胶体金检测ASFV具有重大的临床应用价值。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

用于快速检测非洲猪瘟病毒的RPA扩增与测流层析免疫试纸条相结合的试剂盒，其包含RPA扩增体系和测流层析免疫试纸条；

RPA扩增体系包括用于检测非洲猪瘟病毒的引物以及探针，其中所述的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的序列为：5’-GCC GAA GGG AAT GGA TAC TGA GGG AATAGC AA-3’，下游引物的5’端标记生物素（biotin），其序列为5’-Biotin- TCC CGA GAA CTCTCA CAA TAT CCA AAC AGC AG-3’，所述探针5’端标记荧光报告基团为FAM；所述探针的3’端添加延伸阻断基团（C3-spacer，磷酸基团修饰），第30位被替换成一个四氢呋喃（THF）；所述的探针的序列为5’-6FAM-GAA CAT TAC GTC TTA TGT CCA GAT ACG TG- THF-CCG TGATAG GAG TGA-Spacer C3-3’。