[发明专利]一种合成NMN的双酶共表达菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述双酶共表达菌株同时携带烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶；

其中，所述烟酰胺核糖激酶为NCBI基因序列库中的编号为AJT11364.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列；

所述多聚磷酸盐激酶为NCBI基因序列库中的编号为WP_096454974.1的氨基酸序列或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但多聚磷酸盐激酶活性不变的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述共表达菌株以pRSF-Duet、pETDue-1、pET28a、pCW、pUC或pPIC9k为表达载体。

3.根据权利要求2所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述共表达菌株以pRSF-Duet或pET系列为表达载体。

4.根据权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，烟酰胺核糖激酶基因片段和多聚磷酸盐激酶基因片段前端各有1个T7启动子，相同载体上两个基因片段之间用1-3个RBS序列连接；其中，烟酰胺核糖激酶基因片段为编码上述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列，多聚磷酸盐激酶基因片段为编码上述多聚磷酸盐激酶的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，相同载体上两个基因片段之间用1个RBS序列连接。

6.根据权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株，其特征在于，所述共表达菌株以大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌或枯草芽孢杆菌为宿主细胞。

7.一种如权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将烟酰胺核糖激酶基因片段和多聚磷酸盐激酶基因片段分别扩增回收，并经酶切连接至表达载体上得到重组载体，每个基因片段前端都有T7启动子，两个基因片段中间用1-3个RBS序列连接；

S2、将重组载体转入宿主细胞中得到双酶共表达菌株。

8.一种如权利要求1所述的合成NMN的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述双酶共表达菌株经培养基培养、诱导表达、离心、细胞破碎处理得到同时含有烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸盐激酶的粗酶液，该粗酶液直接用于催化NR合成NMN和ATP的再生。

9.根据权利要求8所述的合成NMN的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述粗酶液用于催化合成NMN时，底物NR的浓度为5-10％。

10.根据权利要求8或9所述的合成NMN的双酶共表达菌株的应用，其特征在于，所述粗酶液用于催化合成NMN时，体系中还加入有多聚磷酸盐和ATP的钠盐，催化反应温度为30-40℃，催化反应时间为5-10h。