[发明专利]一种中性植酸酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种中性植酸酶突变体及其应用。本发明以野生型中性植酸酶AN为基础，获得包含G35E，E169R，T248R单点、两点和三点突变的中性植酸酶突变体，在80℃条件下处理5min后，酶活残留率得到显著提高，从而说明，本发明提供的突变位点G35E，E169R，T248R能显著提高中性植酸酶的耐热性，其中，AN‑7（G35E/E169R/T248R）三点突变的中性植酸酶突变体在80℃条件下处理5min后的酶活残留率最高，为53.22%。本发明提供的中性植酸酶突变体的耐热性得到显著提高，从而有利于其在饲料中的广泛应用。

技术领域

本发明属于基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种中性植酸酶突变体及其应用。

背景技术

植酸是豆类、谷类和油料作物等种子中磷的主要储存形式，植酸酶能够水解植酸生成无机磷和磷酸肌醇衍生物，在动物饲料中添加植酸酶可以有效地提高植酸中磷的利用效率、降低动物排泄物的环境磷污染，并能通过去除植酸的抗营养作用来提高饲料的营养价值，对具有高比活和良好热稳定性植酸酶的需求，促进了酶资源的开发利用以及植酸酶基因工程和蛋白质工程研究，也为更好应用于实践生产奠定基础。中性植酸酶也称螺旋桨植酸酶，主要来源于芽孢杆菌，是耐热性较好，最适反应呈中性（pH 7.0-7.5），能够分解植酸释放磷元素，并且与金属离子有关的一类酶，尤其是对于植酸酶酶活性及稳定性起到至关重要的作用。这一类植酸酶可在鲤科鱼类及单胃动物等值呈中性的肠道中起作用，而酸性植酸酶在中性条件下活性基本丧失，因此，中性植酸酶弥补了酸性植酸酶性质上的不足，可提高植酸酶在动物胃肠道的效用，拓宽植酸酶的应用范围。

中性植酸酶主要指β-螺旋桨(BPP)植酸酶，即β-propeller中性植酸酶，主要来源于芽孢杆菌属。第一个报道的植酸酶是来源于 Bacillus的植酸酶，该酶分子量为43 kDa，最适pH是7.0，最适温度55℃,，酶活性依赖于Ca²⁺的存在。Oh等推测植物来源的植酸酶可能具有与BPP相似的催化机制， Lilium longiflorum花粉和许多豆类植物来源的植酸酶活性与BPP植酸酶一样，在Ca²⁺存在条件下活性显著提高。此外，Zhang等和Huang等分别克隆了天牛肠道菌株 Janthion-bacterium sp.TN 115的中性植酸酶基因和菌株中性植酸酶基因，并将其在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达。

芽孢杆菌来源的β-propeller中性植酸酶都具有相似的酶学性质，其最适范围都在6.0-8.0之间，具有相近的分子量和酶促反应最适pH（7.0左右），具有较高的热稳定性，其催化活性、热稳定性及pH稳定性均依赖于Ca²⁺。Ca²⁺具有稳定植酸酶空间结构的作用。中性植酸酶对植酸盐具存高度的特异性，其最适反应底物是植酸及其盐类复合物，将植酸酶加入到其它含有磷酸基团底物中，检测不到酶活性，且具有较小Km的值，表明对底物的亲和性较好。芽孢杆菌中性植酸酶对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶的抵抗力都很强，对胃蛋白酶却相当敏感，添加少量的胃蛋白酶在短时间内便可将植酸酶降解。

中性植酸酶在食品方面的应用主要是作为食品添加剂添加到食品中，降解植酸，消除其抗营养作用，而提高矿质元素的吸收率，改善人体对矿物质的吸收和提高食品加工技术。由于低磷酸肌醇在生物体内重要的生理作用，所以在医药工业中生产的肌醇及其磷酸盐也备受人们关注。中性植酸酶在农业上的用途主要作为饲料添加剂应用于水产养殖，饲料中添加外源植酸酶可以提高植酸磷的利用率，降低磷的排泄，在虹鳟、斑点叉尾鮰和条纹鲈等几种鱼的饲料中添加植酸酶尤其具有明显的效果，此外还可以提高矿物元素的生物利用率，提高鱼类对蛋白质及脂肪的利用，降低植酸盐的抗营养作用，同时提供营养物质，增加经济效益，所以中性植酸酶制剂的研发在食品、医药及水产养殖领域具有广阔的应用前景。