[发明专利]烟草黄连素桥酶样核酸的靶向诱变

说明书

本发明涉及黄连素桥酶样核酸的修饰，以及它们在调控植物内烟碱生物合成中的用途。

本申请是申请日为2016年12月2日、发明名称为“烟草黄连素桥酶样核酸的靶向诱变”的中国发明专利申请No.201680078771.X的分案申请。

优先权声明

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年12月4日提交的美国临时申请No.62/263,151的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及黄连素桥酶样核酸(bridge enzyme-like nucleic acid)的修饰，以及它们在调控植物内烟碱类生物碱的生物合成中的用途。

背景技术

烟草(普通烟草(Nicotiana tabacum L.))的吡啶生物碱是研究最多的一类植物次生化合物。在大部分烟草基因型中，烟碱构成了总生物碱池的超过90％，并且主要造成烟草产品用户所经历的药理学应答。按相对丰度递减的顺序，烟草中其余的主要生物碱包括新烟草碱,降烟碱和假木贼碱。烟草中生物碱的水平受环境条件、与植物害虫的相互作用以及植物遗传学的影响。

尽管烟碱是给予烟草产品用户以他们所寻求的药理学作用的主要化合物，但在数种情形下希望使用产生并累积极低水平的烟碱的烟草植物来研发产品。例如，一些研究显示，在戒烟策略中使用低烟碱香烟作为成分可以帮助努力戒烟的吸烟者(Hatsukami etal.,2010a；Donny et al.,2014)。其他报告已经证明通过将烟草产品中的烟碱水平降低至临界阈值以下，它们不再能够引发或保持成瘾反应(Benowitz and Henningfield,1994；Benowitz et al.,2007)。诸如此类的研究最终可以影响管理机构，例如美国食品和药物管理局，其职责是确定香烟和其他烟草产品中多种烟草构成成分(包括烟碱)的何种可接受水平。

烟草生物碱的水平也受到关注，这是因为它们在烟草特有亚硝胺(TSNA)的生产中的作用，其为一类潜在的公认的致癌物(Hecht,1998,2003；Hecht and Hoffman,1989)。最重要的TSNA为N-亚硝基降烟碱(NNN)和4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，它们是在烟草的炮制、储存和消耗过程中，分别通过与降烟碱的亚硝基化反应以及烟碱(例如假氧化烟碱)的氧化衍生物衍生的。由于烟草生物碱对于TSNA的形成起到前体的作用，所以低生物碱烟草植物还已经显示会在初烤烟叶中产生减少量的TSNA(Xie et al.,2004)。此外，尽管在炮制环境中的修饰会使得烟熏烟草种类的TSNA大幅减少，但是在风干的白肋烟草类型中却并非如此。

本发明针对的是对植物中调控烟碱生物合成途径的组合物和方法的需求。

发明概述

在一个方面中，本发明提供了生产烟草属植物的方法，其中所述的烟草属植物具有减少的烟碱类生物碱含量，所述的方法包括向植物中引入：(a)在内源BBLe多核苷酸中的突变，所述的多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有97％的同一性；(b)在内源BBLd-1多核苷酸中的突变，所述的多核苷酸与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有97％的同一性；和/或(c)在内源BBLd-2多核苷酸中的突变，所述的多核苷酸与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有97％的同一性，由此产生具有减少的烟碱类生物碱含量的植物。

在第二个方面中，提供具有减少的烟碱类生物碱含量的植物，该植物包含下述多核苷酸中的突变：(a)BBLe多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有97％的同一性；(b)BBLd-1多核苷酸，其与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有97％的同一性；和/或(c)BBLd-2多核苷酸，其与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有97％的同一性。