[发明专利]表皮干细胞外泌体的制备方法

说明书

本发明提供一种表皮干细胞外泌体的制备方法，属于生物技术及医药领域，基于Wnt信号通路的特性，利用Wnts蛋白培养高活性高干性基底干细胞，进而获得细胞外泌体。获得的外泌体具有促进表皮干细胞增殖的Wnts蛋白，具有很强的促进表皮干细胞再生和生长活性的能力；并且具有完备的酶体系，可以修复因损伤修复导致的纤维化瘢痕或皮肤附属物受损问题。

技术领域

本发明属于生物技术及医药领域，具体为一种高活性高干性表皮干细胞外泌体的制备方法。

背景技术

突变或损伤所导致的皮肤衰老和疾病对人类的健康造成了广泛的影响，如何修复损伤使皮肤保持健康、延缓衰老是医学研究的难点之一。随着干细胞领域的发展，通过功能性种子细胞开展皮肤病治疗或用于药物筛选成为新兴的发展方向。干细胞衍生的细胞特异性细胞外泌体通过细胞特异性mRNA或蛋白质介导细胞间通讯，可以调节生物功能并增强组织再生。然而目前获得外泌体的干细胞大多来源于多能性干细胞或者间质干细胞，缺少皮肤特异性和相关功能性，不满足皮肤问题的临床治疗及药物筛选实验需要。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种表皮干细胞外泌体的制备方法，这是一种功能性表皮干细胞定向分化为细胞外囊泡(外泌体)的方法，基于Wnt信号通路的特性，利用Wnts蛋白培养高活性高干性基底干细胞，进而获得细胞外泌体。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种表皮干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

将皮肤组织样本去除皮下组织和脂肪，然后利用分散酶Dispase II(又称中性蛋白酶)进行消化获得表皮层，再利用由胰蛋白酶Trypsin和乙二胺四乙酸EDTA制成的Trypsin/EDTA分别进行消化得到表皮干细胞；

配置培养基，该培养基为Advanced^TMDMEM/F12培养基或RPMI-1640细胞培养基，培养基的组分里含有重组人Wnts蛋白；

利用基质胶Matrigel对孔板进行预包被，等待一段时间后，将培养基加入到孔板的每个孔中；将表皮干细胞接种到含有培养基的孔板中进行培养；

从上述培养表皮干细胞的上清液中分离出表皮干细胞的细胞外囊泡，放入到胎牛血清培养基中进行生长，在达到70％～80％融合后，取出加入到另一份去除了牛细胞外囊泡的胎牛血清的培养基中进行培养一段时间；

将上述培养一段时间的培养基进行第一次离心，去除死细胞；再将上清液进行第二次离心，消除污染的细胞碎片；再进行第三次离心沉淀出细胞外囊泡，通过洗涤沉淀去除污染的蛋白质；再进行第四次离心去除上清液，分离出细胞外泌体。

进一步地，利用Dispase II进行消化的条件是：在37℃条件下用Dispase II消化组织若干小时。

进一步地，利用Trypsin/EDTA进行消化的条件是：将表皮层用预热的Trypsin/EDTA在37℃条件下消化8～15分钟，以1000×g～1500×g离心2.5～3.5分钟，并在4℃条件下用PBS洗涤若干次。

进一步地，Advanced^TMDMEM/F12培养基的组分除了包含重组人Wnts蛋白以外，还包含非必需氨基酸NEAA、B-27^TM添加剂、高级细胞培养添加剂GlutaMAX^TM、非离子两性缓冲液HEPES、N-乙酰半胱氨酸N-Ace、重组人表皮生长因子蛋白hEGF、通路抑制剂A83-01、真核腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、青霉素链霉素双抗溶液。