[发明专利]一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D2的方法

说明书

本发明公开了一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D2的方法，属于生物催化合成技术领域。本发明通过挖掘得到一种具有催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D2的糖基转移酶UGT94D1，并将糖基转移酶UGT94D1与来源于拟南芥的蔗糖合酶AtSuSy构建偶联反应，实现以莱鲍迪苷A为底物高效催化合成莱鲍迪苷D2，以9.67g/L(10mmol/L)莱鲍迪苷A为底物反应24h，高效合成10.69g/L的莱鲍迪苷D2，莱鲍迪苷D2产率达到94.66％，为莱鲍迪苷D2的生产提供了一条高效且绿色的新途径。

技术领域

本发明涉及一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D2的方法，属于生物催化合成技术领域。

背景技术

甜菊糖苷是从甜叶菊叶子中提取和纯化的二萜糖苷，具有高甜度、低热量、对人体无副作用等优点。甜菊糖苷已被美国、巴西、韩国、日本和欧洲食品安全局批准为安全食品添加剂。到目前为止，已从甜菊叶中鉴定出64种甜菊醇糖苷，其中，甜菊糖含量最高，占干重的5-10％，其次是莱鲍迪苷A，占干重的2-4％。他们表现出比蔗糖高250-300倍的甜度，但即使是高纯度的甜菊糖苷也保留了苦味的属性，这在很大程度上限制了它们在天然食品添加剂市场中的应用。

近年来研究发现，C-13和C-19所连接的糖基单元的数量及种类对甜菊糖苷的性质有显著影响。例如，莱鲍迪苷A的C-13位置上有一个额外的葡萄糖，使其比甜菊糖更甜更可口。甜叶菊中进一步分离得到的莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M在C-19位置上连接有一个和两个额外的葡萄糖，使其表现出比莱鲍迪苷A更好的甜味品质。因此人们非常关注在这些位置上具有不同的糖基单元的新型甜菊糖苷以挖掘具有更好品质的甜味剂。

UDP-葡萄糖基转移酶(UGTs)是一种天然进化的催化糖基化反应的酶，它们将糖部分从活化的糖供体转移到受体分子上。UGTs在甜菊糖苷的合成中已经有了许多的应用。2014年，Prakash等人首次报道了一种新型甜菊糖苷衍生物-莱鲍迪苷D2，其是糖基转移酶UGTSL2催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的次要产物，最近，GuoHong Mao报道了糖基转移酶EUGT11催化莱鲍迪苷E转化为莱鲍迪苷D2。但是由于产率较低，产物混杂，分离纯化成本高或底物莱鲍迪苷E价格昂贵，限制了对莱鲍迪苷D2的进一步研究。因此，鉴定一种新的具有高催化活性和区域选择性的糖基转移酶，利用相对常见的起始底物(例如莱鲍迪苷A)合成莱鲍迪苷D2是非常有必要的。

发明内容

为解决上述问题，本发明挖掘来自芝麻的糖苷转移酶UGT94D1催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D2，在尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)存在的情况下具有催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D2的活性。并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖UDPG循环再生体系，利用大肠杆菌裂解液实现高效生物合成莱鲍迪苷D2，为莱鲍迪苷D2的进一步研究提供了可能性。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种表达来源于芝麻的糖基转移酶的重组菌。

在一种实施方式中，所述糖基转移酶的氨基酸序列的登录号为XP_011076907.1，核苷酸序列的登录号为XM_011078605.1。

在一种实施方式中，所述重组菌还表达蔗糖合酶。

在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶活性的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_001031915。

在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。

在一种实施方式中，所述重组菌为将糖基转移酶构建至pET-21b(+)载体，将蔗糖合酶构建至pACYCDuet-1载体。