[发明专利]一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法

权利要求书

1.一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下实施步骤：

T1：构建重组表达质粒PET-32a-N1N2

以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增得到目的片段，构建克隆质粒pMD-18T-N1N2，对克隆载体和原核表达载体pET-32a同时进行双酶切，连接后得到重组表达质粒pET-32a-N1N2；

T2：对目的蛋白进行表达及纯化

将构建重组表达质粒PET-32a-N1N2转入E.coliBL21(DE3)，诱导表达融合蛋白，利用His柱层析进行纯化，得到经SDS-PAGE电泳分析纯度较高的蛋白；

T3：建立间接ELISA检测方法

利用纯化的PET-32a-N1N2蛋白，建立间接ELISA检测方法，确定PET-32a-N1N2蛋白抗原的包被浓度为0.075μg/孔，包被条件为4℃过夜；血清的稀释度和反应时间分别为1:200和37℃60min；封闭液(1％BSA)封闭时间为37℃60min；羊抗猪IgG-HRP使用浓度和反应时间分别为1:5000和37℃60min；底物25℃避光反应20min。

2.根据权利要求1所述一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤T1中，针对N1基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5’-ACGCGTCGACAAGATCACACGCCCAAAAT-3’；针对N2基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5’-CGCGGATCCTTATGCGAGGTAACATCACAAAC-3’。

3.根据权利要求1所述一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤T3中，针对PRRSV-NSP2-N1N2蛋白样本阴阳性临界值，判定标准是：当样本0D4500.4401时(P/N＞2.5)判定为阳性，当样本0D450＜0.4401判定为阴性。

4.根据权利要求1所述一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤T2中，纯化所得的目的蛋白，经Western blot检测能与6×His-Tag Antibody Mousemonoclonal抗体特异性结合。

5.根据权利要求1所述一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤T2中，纯化所得的目的蛋白为可溶性蛋白。

6.根据权利要求1所述一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤T2中对目的蛋白的诱导表达的最佳条件为IPTG浓度为1.2mM条件下，诱导8小时。

7.根据权利要求1所述一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤T1中所得pET-32a-N1N2重组质粒大小为307bp。

8.根据权利要求1所述一种梅山猪气喘病间接ELISA检测方法，其特征在于，PET-32a-N1N2蛋白皆不与猪瘟病毒(HCV)，猪伪狂犬病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株抗体阳性血清发生反应。