[发明专利]一种杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin的基因工程制备方法

说明书

本发明公开了一种杂交鲈鱼抗菌肽wb‑moronecidin的基因工程制备方法，具体为杂交鲈鱼抗菌肽wb‑moronecidin的表达载体pPIC9K‑wb‑moronecidin的构建、诱导表达产物和纯化。具体操作为：载体pPIC9K中插入了用于重组表达序列为SEQIDNo.1的wb‑moronecidin基因序列，构建表达载体pPIC9K‑wb‑moronecidin，表达载体在宿主细胞毕赤酵母中进行诱导表达，获得表达产物重组多肽wb‑moronecidin。本发明利用基因工程表达方法生产获得的抗菌肽wb‑moronecidin，具有明显的抑菌活性，降低生产成本，缩短生产周期，增加产量，能够在水产养殖业、医药行业中产业化应用。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin的基因工程制备方法。

背景技术

抗菌肽是存在于生物体内能抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽，它是先天免疫系统的重要组成部分，多数抗菌肽具有抗微生物活性，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和病毒都有抑杀作用，有些抗菌肽还具有抗菌特异性。抗菌肽抑菌机理主要是作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡，不易产生耐药性，因此抗菌肽的产业化应用是解决抗生素抗药性问题的一条有效途径。

目前抗菌肽的产业化应用研究还处在起步阶段，常用的生产方法主要有生物提取法、化学合成法和基因工程表达。天然抗菌肽在生物体内含量极低，靠天然物提取应用是不可能的，且生物提取法的生产成本高，不能满足规模化生产的需求。化学合成法是利用已知氨基酸序列的抗菌肽来化学合成，但合成的大多为3-9个氨基酸序列组成的线性短肽，且化学合成毒性大，成本高，产量低，周期长，合成1kg具备20个氨基酸的抗菌肽的成本约为2000万元，严重制约抗菌肽的产业化发展。

杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin由28个氨基酸序列组成，对单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）等多种细菌具有较好的抑菌效果。但由于杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin天然提取产量少，成本高；化学合成的杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin毒性大，成本高，产量低，周期长，严重限制了杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin的产量和产业化应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin的基因工程制备方法，利用基因工程表达方法生产获得抗菌肽wb-moronecidin，具有明显的抑菌活性，降低生产成本，缩短生产周期，增加产量，解决杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin的产量瓶颈和产业化应用的问题。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin的制备方法，包括以下步骤：

S01. 杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin表达载体pPIC9K-Wb-moronecidin的构建，具体操作如下：PCR扩增杂交鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin基因序列，获得抗菌肽wb-moronecidin的目的基因片段，将wb-moronecidin基因片段与pPIC9K载体连接，得到pPIC9K-wb-moronecidin重组载体；

S02.将步骤S01获得的重组载体转化入宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

S03.对步骤S02获得的表达产物进行分离纯化，获得重组多肽wb-moronecidin。

进一步的，步骤S02中所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。

进一步的，步骤S03中所述分离纯化的方法具体特征在于：先对表达产物进行离心，收集上清液，进行透析后，最后进行亲和层析法纯化。