[发明专利]高产洋橄榄叶素的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种高产洋橄榄叶素的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程和微生物技术领域。本发明高产洋橄榄叶素的基因工程菌为过表达ORF8022基因(Seq ID No.1)和/或ORF8003基因(Seq ID No.2)的链霉菌，其构建方法包括如下步骤：构建强启动子元件驱动目的基因表达的过表达质粒，通过接合转移的方法将所构建质粒转移到产生洋橄榄叶素的链霉菌宿主中。本发明通过基因工程手段，对可能的洋橄榄叶素生物合成相关的内源基因ORF8022基因和ORF8003基因进行过表达，使洋橄榄叶素的产量得到大幅度提高。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种高产洋橄榄叶素的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

洋橄榄叶素是一类具有对称结构的十六元环大环内酯类抗生素，最早分离自Streptomyces melanosporus，目前已经有许多不同链霉菌菌株产生洋橄榄叶素的报道。1982年洋橄榄叶素的绝对构型通过X-射线晶体检测得以确定，并且在1986年时完成了化学全合成。

研究表明，洋橄榄叶素及其同系物具有出色的生物活性，具有潜在的成药价值：1)抗革兰氏阳性菌活性，例如枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、分枝杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌等,杀菌机制尚不明确。对耐药的革兰氏阳性细菌也能表现出很好的活性，例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(MRSA和MRSE)，耐万古霉素的粪肠球菌和屎肠球菌(VRE)。对革兰氏阴性细菌没有活性。2)对是酵母和丝状真菌没有活性，但是有实验数据证明其在联合使用时，可以显著提升雷帕霉素的抗真菌活性。3)驱虫活性。部分天然组分有抗恶性疟原虫活性。一些以洋橄榄叶素类化合物天然结构为基础，经过化学修饰产生的半合成化合物在100ppm浓度下就对秀丽隐杆线虫表现很强的驱虫活性。4)抗癌活性。洋橄榄叶素具有中等的细胞毒活性，可以抑制自噬，诱导细胞凋亡，抗血管增生。5)免疫抑制活性。多种洋橄榄叶素类化合物表现出免疫抑制活性，其中某种组分已经进入银屑病、缺血再灌注和过敏的临床前研究。6)某些组分能够抑制α-葡萄糖苷酶，具有抗病毒活性。

根据洋橄榄叶素的化学结构可以推测其碳骨架是由I型聚酮合酶催化完成。2004年，洋橄榄叶素的生物合成基因簇由英国Leadlay教授课题组从S.malaysiensis DSM4137中克隆得到，长度超过60kb，含有5个聚酮合酶基因成簇排列，负责洋橄榄叶素大环内酯骨架的合成。聚酮合酶基因上下游分布7个与糖基合成以及转运相关的基因，所编码的蛋白负责洋橄榄叶素的糖基化。基因簇中还包含一些调控基因和转运基因。2015年由美国Taifo教授课题组在Streptomyces sp.ICBB 9297中再一次推测了洋橄榄叶素的生物合成途径，以及9种不同组分形成的机制，5个核心I型PKS基因编码的蛋白含有8个模块，负责两个线性聚酮链的合成。同年，英国Leadlay教授课题组的周永军等人对编码独立的II型硫酯酶结构域TE的基因ela1*进行深入研究，证明其负责两条链环化形成洋橄榄叶素骨架结构。2017年，云南大学鲁涛教授和文孟良教授课题组在S.autolyticus CGMCC0516中发现格尔德霉素生物合成基因簇所包含的一个调控基因gdmRIII正调控格尔德霉素生物合成的同时，负调控洋橄榄叶素的生物合成。

链霉菌219807是洋橄榄叶素的产生菌，在实验室摇瓶发酵时，其产量一般维持在1g/L左右。为了进行规模化制备，获得足够量的纯品投入后期的研究工作，需要进一步提高其产生菌的效价。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产洋橄榄叶素的基因工程菌及其构建方法与应用，用于制备洋橄榄叶素类化合物。

本发明的第一个目的是提供高产洋橄榄叶素的基因工程菌。所述的基因工程菌是通过在产生洋橄榄叶素的链霉菌宿主中过表达以下基因中的至少一种获得：

(a)ORF8022基因，是指功能未确定的NAD(P)依赖的氧化还原酶基因，核苷酸序列如Seq ID No.1所示；