[发明专利]一种无核酸扩增的单分子RNA定量检测方法及系统

说明书

本发明提供了一种无核酸扩增的单分子RNA定量检测方法及系统，包括：S1：制备单链RNA荧光报告探针功能化修饰的微球；S2：设计靶标RNA特异性的crRNA；S3：将已知浓度的靶标RNA、crRNA、Cas13蛋白、反应缓冲溶液和S1制备微球在适宜的温度下共同孵育；S4：将S3孵育后的微球进行荧光成像，建立微球荧光强度和RNA浓度之间线性对应关系；S5：利用S4建立的线性对应关系对样品中RNA定量检测。本发明所述的RNA检测方法可实现单分子水平RNA定量分析，无需逆转录及核酸预扩增步骤，检测条件温且操作步骤简单，为RNA诊断分析提供了一种高灵敏度简便、通用新策略。

【技术领域】

本发明涉及分子诊断与生化分析方法研究领域，尤其涉及一种无核酸扩增的单分子RNA定量检测方法及系统。

【背景技术】

作为重要的遗传物质，RNA各个生物过程中的发挥至关重要作用，从基础生物学研究到分子生物学探索再到临床诊断分析，高灵敏度、高特异性的RNA检测显得越来越重要。例如，基于新型冠状病毒 (SRAS-CoV-2)基因组RNA的核酸检测，作为新型冠状病毒病(COVID-19) 诊断的金标准，在COVID-19的预防和控制中发挥着至关重要的作用；再如，由染色体重排所形成的融合基因转录本RNA，被国家综合癌症网络肿瘤学临床实践指南(National Comprehensive Cancer Network Clinical Practice in Guidelines inOncology，NCCN指南)和世界卫生组织蓝皮书(WHO Blue Books)作为各类癌症分类、诊断、治疗、预后和微小残留灶监测的分子标志物。

目前，RNA检测主要依赖于核酸扩增技术，包括逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，连接酶链式反应(LCR)，重组酶扩增技术(RPA)，环介导等温核酸扩增(LAMP)等等。由于高效的指数扩增机制，这些方法获得了非常高的灵敏度，甚至达到了单分子水平。然而，这些方法通常需要逆转录/连接步骤以将RNA转化为DNA，以及随后的DNA复制步骤以产生可检测的核酸水平。但扩增步骤往往会引入一些比较棘手的问题，例如由于逆转录不完全导致的目标RNA分子丢失、易错序列复制导致的扩增偏差以及污染导致的假阳性结果。此外，需要精心设计多个靶标特异性探针/引物，使用多种工具酶，需要严格优化实验条件。因此，迫切需要发展一种通用RNA定量检测方法，该方法不仅具有核酸扩增技术一样的灵敏度，而且避免了上述核酸扩增所存在的问题。

研究发现CRISPR/Cas13a系统具有靶标依赖性反式切割活性，它能够通过crRNA对靶标RNA进行特异性识别并与之结合，并激活它的反式切割活性，Cas13a的反式切割活性能够高效地水解周围环境中存在的单链RNA报告探针，由此实现无扩增的RNA检测。虽然CRISPR/Cas13a系统具有多重响应机制，但只能检测pM以上的RNA，无法满足大多数实际样本分析需求。最近，研究人员通过串联的CRISPR/Cas系统和设计多 crRNA CRISPR/Cas13a系统，使无扩增RNA分析的灵敏度提高到了fM水平，但这无疑增加分析成本，使设计复杂化；即便如此，仍然无法满足 aM水平的RNA定量检测。

【发明内容】

鉴于此，本发明提供了一种通用、简便的无核酸扩增单分子RNA定量检测方法。

本发明所提供RNA定量检测方法包括以下步骤：

S1：制备单链RNA荧光报告探针功能化修饰的微球；

S2：设计合成靶标RNA特异性的crRNA；

S3：将已知浓度的靶标RNA、crRNA、Cas13蛋白、反应缓冲溶液和 S1制备微球在适宜的温度下共同孵育；

S4：对S3孵育后的微球进行荧光成像，建立微球荧光强度和RNA浓度之间线性对应关系；

S5：利用S4建立的线性对应关系，对样品中RNA定量检测。