[发明专利]牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建及其应用

权利要求书

1.牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：选取屠宰场中荷斯坦奶牛的新鲜肝脏组织，称取20mg肝脏组织提取总RNA，反转录成cDNA，并放置在-20℃保存备用；

步骤二：选择pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体，设计引物，并从NCBI数据库中获得奶牛RORα基因预测序列的CDS区；

步骤三：使用Primer Premier 5.0软件设计带有EcoRI酶切线性化pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体的同源臂的PCR引物。

2.根据权利要求1所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：在步骤二中从NCBI数据库中获得奶牛RORα基因预测序列的CDS区的登录号为XM_024997674。

3.根据权利要求2所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：在步骤二中设计的引物序列为：

F:5-agcaagctttctagagaattcATGATGTATTTTGTGATCGCAG-3；

R:5-accggat-ccgatatcgaattcTTACCCATCAATCTGCATGGCT-3。

4.根据权利要求3所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：其中agcaagctttctagagaattc以及accggat-ccgatatcgaattc为EcoRI酶切线性化pcDNA-3.1-Puro-N-3HA载体的同源臂；

其中gaattc为EcoRI酶切位点。

5.根据权利要求4所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：在步骤一中cDNA的制备采用TOYOBO逆转录反应试剂盒操作步骤获得cDNA；

去除基因组DNA反应体系8μL：4×DN Master Mix2.0μL、RNA template4μL、ddH2O 2μL；

反应程序：37℃5min、逆转录反应体系10μL、去除基因组DNA反应液8μL、5×RT MasterMixⅡ2μL；

反应程度：37℃15min；50℃5min；98℃5min；4℃保存。

6.根据权利要求5所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：通过步骤一获取了cDNA为模板，扩增奶牛RORα基因带有同源臂的CDS区片段；

PCR反应体系50μL：cDNA 4μL(50ng/μL)、上下游引物(10μM)各1.5μL、2×PrimeSTARMax Premix 25μL、ddH2O 18μL；

PCR反应程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸85s，循环40次(step 2-4)；72℃总延伸5min；16℃∞；

PCR反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，对目的基因DNA片段按照通用型DNA纯化回收试剂盒说明书进行纯化回收。

7.根据权利要求6所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：将空载体pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体用限制性内切酶EcoRI进行线性化处理，并通过琼脂糖凝胶电泳实验检测酶切产物，反应体系50μL：10×QuickCut Green Buffer 5μL、限制性内切酶EcoRI 5.5μL、pcDNA3.1载体9.7μL、ddH2O 29.8μL、37℃反应1h 30min，随后将目的条带使用通用型DNA纯化回收试剂盒进行胶回收，得到线性化载体备用。

8.根据权利要求7所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体的构建，其特征在于：将目的片段与线性化的pcDNA3.1载体进行重组连接，反应体系20μL：线性化载体0.869μL、插入片段5.6μL、5×CEⅡBuffer 4μL、ExnaseⅡ2μL、ddH2O 7.531μL，37℃反应30min，降至4℃或立即置于冰上冷却，得到重组质粒产物。

9.根据权利要求8所述的牛RORα基因的克隆、真核表达载体构建，其特征在于：按照转化反应操作说明将重组产物转至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂于含氨苄霉素(30μg/mL)的固体培养基中；

37℃培养箱中培养12h～16h，之后挑取单克隆菌落在37℃摇床摇菌12h；

以菌液为DNA模板进行PCR扩增检验菌液中是否含有阳性克隆，反应体系：2×QuickTaq HSDyeMix 7.5μL、上下游引物各0.5μL、菌液2μL、ddH2O加至15μL，反应程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸85s，循环35次；68℃总延伸5min；16℃∞；

根据无内毒素质粒小提中量试剂盒说明书提取阳性质粒并检测其浓度；

随后使用限制性内切酶EcoRI对其进行单酶切鉴定，将酶切鉴定结果符合预期的阳性质粒送至西安擎科生物有限公司进行测序鉴定；将返回的序列与NCBI数据库中奶牛RORα基因CDS区序列进行比对，将比对正确的质粒样品命名为pcDNA3.1-3HA-RORα。