[发明专利]一种高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法及用途

说明书

本发明公开了一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法及用途，涉及生物能源技术领域。本发明利用PCR获得希瓦氏菌内源编码乳酸透过酶基因SO1522，编码NAD⁺依赖型氧化酶基因gapA和基因mdh，以及编码NADH氧化脱氢酶基因ndh。在希瓦氏菌中逐级串联表达上述基因得到高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株SA‑E。本发明构建的一种高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株SA‑E能够强化底物摄取、加快胞内NADH再生和促进NADH氧化脱氢释放电子，进而高效地将电子通量从电子供体定向至电子转移链，从而增强胞外电子传递速率，提高微生物燃料电池的输出功率。

技术领域

本发明涉及生物能源技术领域，更具体的说是涉及一种高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法及用途。

背景技术

微生物燃料电池是利用电活性微生物的细胞内生理代谢和细胞外电子传递，将储存在有机物中的化学能转换为电能的一种新兴且有良好前景的生物技术。其中，电活性微生物作为核心催化剂，其催化活性能直接决定着微生物燃料电池的性能。

希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1(简称S.oneidensis MR-1)是在基因组序列注释和遗传特性方面研究最充分的外产电菌之一，其细胞内代谢路径和细胞外电子传递机制已被广泛研究和阐明。希瓦氏菌S.oneidensis MR-1的产电机制主要是通过氧化电子供体产生生物电子，并在细胞内以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的形式储存，随后在NADH氧化脱氢酶催化下将电子释放至胞外电子转移途径，随后通过直接电子传递或间接电子传递的方式将电子传递到微生物燃料电池的阳极。近年来，利用合成生物学策略强化胞外电子传递过程已被广泛研究，包括可利用葡萄糖、木糖的希瓦氏底盘菌改造以拓宽希瓦氏菌底物谱，胞内NAD⁺的从头合成和胞内NADH再生的强化以增强细胞内可释放电子池和希瓦氏菌的胞外电子传递速率。然而，从电子供体至电子转移链的电子通量低仍是影响胞外电子传递效率的关键因素。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株。

本发明的第二个目的是提供一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：PCR获得希瓦氏菌内源编码乳酸透过酶基因SO1522，编码NAD⁺依赖型氧化酶基因gapA和mdh，以及编码NADH氧化脱氢酶基因ndh，在希瓦氏菌中逐步串联表达上述基因得到高效定向电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株SA-E；

本研究使用无缝克隆连接的方式构建质粒。片段与片段见存在同源臂，利用重叠PCR可获得四个基因片段连在一起的一个完整基因片段；同时将载体(环状空质粒)进行反向PCR获得线性化载体，之后利用无缝克隆连接酶将线性化载体和基因片段连接为目标质粒。

有益效果：本发明通过逐级串联表达希瓦氏菌内源性的内膜乳酸通透酶基因SO1522，调控细胞内NADH再生的NAD+依赖型氧化酶基因gapA和mdh，以及细胞内膜上编码NADH氧化脱氢酶的基因ndh，构建了一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株。该菌株不仅能够提高了MFCs的电化学性能，而且弥补希瓦氏菌强化胞内电子通量至电子传递链的研究空缺。

本发明构建了一种高效定向胞内电子通量至电子转移链的重组希瓦氏菌株，该菌株能够强化底物摄取、加快细胞内NADH再生和促进NADH氧化脱氢释放电子，进而高效地将胞内电子通量从电子供体定向至电子转移链，从而增强胞外电子传递速率，提高微生物燃料电池的输出功率。

附图说明