[发明专利]可羟基化黄体酮C11α位的P450酶及其基因、表达载体、细胞及应用

说明书

本发明涉及一种可羟基化黄体酮C11α位的P450酶及其基因、表达载体、细胞及应用，属于酶工程技术和基因工程技术领域。来源于原核微生物巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H‑1的黄体酮P450羟化酶CYP BMH3及其基因序列cyp bmh3，该基因全长1233bp，编码410个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示；并基于该酶的异源表达实现了黄体酮的高效转化，同时专一性高，减少反应副产物，降低了生产成本，为其进一步的工业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及酶基因工程及酶工程技术领域，尤其涉及一种可羟基化黄体酮C11α位的P450酶及其基因、表达载体、细胞及应用。

背景技术

孕酮(progesterone)，亦被称为黄体酮、孕甾酮、黄体甾酮、助孕激素、助孕素、黄体素或助孕酮，其缩写为P4，全称孕甾-4-烯-3,20-二酮，是一种内源性类固醇和孕激素性激素，也是在体内的主要孕激素，由女性的卵巢分泌。黄体酮是由卵巢黄体细胞分泌的一种含有21个碳原子的类固醇激素，也是合成一切类固醇激素的中间产物，属于孕激素之一。有两种晶型，即α-型和β-型，两种晶型有类似的生理活性，α-型是从稀乙醇中析出，为正交晶系白色棱柱状结晶，β-型为正交晶系白色针状结晶，二者均不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等。自然界中，黄体酮广泛存在于动物体内，有维持雌性动物的妊娠，促进子宫粘膜层增厚、腺体的弯曲度以及分泌机能的增加等生理功能。甾醇的羟基化反应是指在有机分子上引入羟基的反应，甾体类化合物通过羟基化修饰后，一般会表现出更好的药理活性，常见的羟基化黄体酮药物中间体有11α-OH-黄体酮，作为黄体酮最重要的羟化中间体之一，11α-OH-黄体酮又被称为11α-OH-孕酮，分子式为C₂₁H₃₀O₃，相对分子质量为330.46，报道称其可以选择性地抑制11β-羟基类固醇脱氢酶II，这是一种在调节肾脏电解质平衡中很重要的酶，它能将人体内的皮质醇代谢成肾上腺皮质酮，因此，11α-OH-黄体酮可以影响血压调节。此外，11α-OH-黄体酮具有抗雄激素活性，对雌激素和孕激素副作用较小，所以在临床应用研究领域具有很大的潜力。

11α-OH-黄体酮的制备方法包括化学法和生物法。化学法合成11α-OH-黄体酮的合成路线是以11α-乙酰黄体酮为原料，通过多步缩合，开环和异构化等反应获得11α-OH-黄体酮，该过程反应步骤多、转化率低，且分离纯化过程复杂。1952年，Peterson和Murray首次发现黑根霉(Rhizopusnigricans)对甾体具有C-11α羟化能力，从而使黄体酮到皮质酮的合成缩短为三步，收率达90％，从此解决了可的松等皮质激素类化合物合成的难题，由此开创了微生物转化甾体化合物的先例。

目前关于黄体酮微生物羟基转化的研究非常广泛，如黄竹梅(黄体酮和环氧黄体酮微生物羟基转化的研究,四川师范大学,2013.DOI:10.7666/d.Y2301348.)使用新月弯孢霉和蓝色犁头霉菌分别对黄体酮进行发酵转化，转化液经萃取、浓缩，获得产物粗产品，再通过硅胶柱层析分离纯化，发现黄体酮的转化产物中含有11α-OH-黄体酮；专利CN202110142291.8公开了一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，以17α-OH-黄体酮为底物制备11α,17α-OH-黄体酮；专利CN202010405130.9公开了一种11α-羟化酶突变体，基于该突变体构建的重组毕赤酵母可转化底物黄体酮为11α-OH-黄体酮。但以上针对黄体酮微生物羟基转化的方法多是利用真菌等真核体系进行生物催化，真菌催化虽然转化效率良好，但其遗传特性不清晰，分子操作体系不完善，且转化过程中伴随诸多副产物，不利于下游产物高效分离等工作的进行，而对于细菌等原核体系，随着近些年生物技术的飞速发展，其遗传操作体系已非常成熟，因此需要寻找一种新的利用原核生物体系制备11α-OH-黄体酮的方法。

发明内容