[发明专利]检测木瓜秀粉蚧LGMN基因转录水平的引物及方法

权利要求书

1.一种检测木瓜秀粉蚧LGMN基因转录水平的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：

LGMN-F：5`- GCTACCATATCCTCCACCAC-3`，

LGMN-R：5`- TTTTCTCTTCAGCATTCAAC-3`。

2.一种采用权利要求1所述的荧光定量PCR引物检测木瓜秀粉蚧LGMN基因转录水平的荧光定量PCR方法，其特征在于：按如下步骤：

（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；

（2）以下述引物进行常规PCR检测：

木瓜秀粉蚧LGMN基因的荧光定量上下游引物：

LGMN-F：5`- GCTACCATATCCTCCACCAC-3`，

LGMN-R：5`- TTTTCTCTTCAGCATTCAAC-3`；

内参基因Tubulin的上下游引物：

Tubulin-F: 5`-CTTCACTTCTTCATGCCTGG-3`，

Tubulin-R: 5`-TTTGTTCGTCAACTTCTTTC-3`；

常规PCR扩增体系总体积为20µL：2X Taq Plus Master Mix 10µL，5uM上游引物0.8µL，5uM下游引物0.8µL，100ng/µL cDNA模板1.0µL，水7.4µL；

常规PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后95℃变性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；

（3）实时荧光定量PCR反应：

以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值；

实时荧光定量PCR扩增体系为：2X ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10µL，5uM上游引物0.8µL，5uM下游引物0.8µL，50 X ROX Reference Dye 2 0.4µL，100 ng/µL cDNA2.0µL，补足水至20µL；

实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性5 s 、50℃退火30 s、72℃延伸40 s，40个循环。