[发明专利]一种细粒棘球蚴重组抗原P29优势表位肽筛选及应用

说明书

本发明公开了一种细粒棘球蚴重组抗原P29优势表位肽筛选，涉及生物工程技术领域，包括如下步骤：S1、表位肽设计；S2、B细胞表位混合肽的筛选；S3、B细胞表位单肽筛选；S4、B细胞优势表位肽的优化筛选；S5、T细胞表位混合肽筛选；S6、T细胞表位单肽筛选；S7、B细胞优势表位肽的应用；S8、T细胞优势表位肽的应用。本发明筛选出三条B细胞优势表位肽：P1、P2、P3，可以识别免疫绵羊血清中的IgE、IgG1与IgG2抗体，能够体外识别P29免疫的小鼠血清中IgG、IgM、IgG1抗体，具有较好的抗体识别效果；筛选出两条T细胞优势表位肽：ID18与ID28，能够体外刺激免疫绵羊PBMC产生细胞因子IFN‑γ，具有较好的诱导细胞免疫潜力。为包虫病的P29多表位肽疫苗开发奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种细粒棘球蚴重组抗原P29优势表位肽筛选及应用。

背景技术

细粒棘球蚴病，又称为包虫病，由棘球绦虫的幼虫寄生于动物(包括人)体内而引起，为常见的人畜共患寄生虫病。细粒棘球蚴病呈现出全球分布的特点，在欧洲东部、东非、中东及亚洲中部等区域广泛流行，特别是畜牧业发达地区更加明显。中国是全球包虫病发病最为严重的地区之一，在西部畜牧业较为发达的地区分布更为广泛。包虫病不仅严重危害人民身体健康，并且对畜牧业发展产生了严重不利影响，在医疗和畜牧业方面造成了巨大开支和经济损失。通常，包虫病的防治包括了预防和临床治疗两个环节。通过免疫手段防治传染病具有较长的历史，免疫预防的作用与效果也越来也突出，展现出了其他防治手段无法比拟的优势。随着分子生物学、细胞生物学、免疫学等多学科的快速发展及交叉融合，从传统疫苗、基因工程疫苗开发，到核酸疫苗、多肽疫苗及多价疫苗等研究，广大科研工作者在包虫病疫苗研制方面做了许多工作，取得了一定的研究成果。

传统的抗寄生虫疫苗的保护性抗原多采用全蛋白，而全蛋白的成分相对比较复杂，既含有发挥免疫保护效果的有效表位，即“优势表位”，也含有无效表位，甚至具有抑制免疫作用的表位。多肽疫苗是根据已知或预测的棘球蚴有效保护性抗原中某段抗原表位的氨基酸序列，通过人工设计，并进一步合成的具有免疫原性的疫苗。表位肽疫苗相对于传统疫苗具有很多优势，比如能够选择性提高有效应答、去除无关表位后降低疫苗副作用、组合的多表位肽疫苗可以增加免疫应答的宽度等。优势表位筛选是开发表位疫苗的前提，在表位层面对抗原筛选优化，能够诱导更有效的免疫应答，也确保了免疫特异性和安全性。P29能够有效诱导绵羊持续的体液免疫及细胞免疫应答，是较好的包虫病疫苗候选分子。本课题组已在小鼠动物模型开展了P29表位肽疫苗的研究，确定的抗原优势表位诱导小鼠产生了较好的免疫反应，但在绵羊等大型实验动物上缺乏相关数据资料。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种细粒棘球蚴重组抗原P29优势表位肽筛选及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种细粒棘球蚴重组抗原P29优势表位肽筛选，包括如下步骤：

S1、表位肽设计：

根据重叠肽设计原则，设计单肽长度为15个氨基酸，步移5个氨基酸，重叠部分10个氨基酸，共设计45条重叠单肽，覆盖rEg.P29的238个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ IDNO.1；

S2、B细胞表位混合肽的筛选：

选取IgG抗体表达水平最高时间点的第6周，即第二次免疫后2周血浆，初步对单肽对应的混合肽进行筛选，具体为：

S201、混合肽rEg.P29包被：用包被缓冲液稀释(碳酸盐缓冲液，pH 9.6)各混合肽，终浓度均为5μg/ml，在酶标板中每孔加入100μl肽或抗原包被液，于4℃冰箱过夜孵育；