[发明专利]一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法。本发明方法包括：第1天将诱导多能干细胞置于诱导培养基1（含Y‑27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin）中培养；第2‑3天转入诱导培养基2（含CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin）中培养；第4天转入诱导培养基3（含Y‑27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸）中培养；第5‑10天转入诱导培养基4（含SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸）中培养；获得颈段脊髓神经干细胞。本发明能够从诱导多能干细胞特异性的诱导生成针对颈段的脊髓神经干细胞，从而为治疗颈段部位的脊髓损伤提供了可能性。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法。

背景技术

神经退行性疾病和创伤性中枢神经系统疾病，会出现神经细胞进行性退化和死亡，导致严重神经功能缺损，大部分缺乏有效治疗方法。以脊髓损伤、脊髓炎、脊髓前角病变为代表的疾病出现脊髓变性病理改变，包括神经细胞的凋亡、脱髓鞘和神经胶质瘢痕的形成，患者临床表现为肢体无力、肌肉萎缩、感觉异常和二便功能障碍等。损伤或炎症后继发的胶质增生、炎症细胞浸润、轴突逆行性华勒变性等，会进一步加重症状。而由于中枢神经系统细胞的不可再生性，上述变性过程很难自行逆转。脊髓损伤修复需要轴突再生、髓鞘再生、缺失细胞（神经元和神经胶质细胞）的替换，并提供一个适合损伤细胞再生的微环境。目前，干细胞疗法为几乎所有形式的神经退行性和创伤性疾病提供了可能。

神经干细胞的一个特性是自我更新和多能性，即它们可以产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，因此理论上可以补充凋亡的神经细胞，或为濒临坏死的神经元提供神经营养因子从而挽救其功能，或帮助组织对抗炎症损伤过程。因此，它们对神经功能障碍的治疗和受损神经系统的修复具有重要意义。

目前，神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导获得或直接从成年哺乳动物的中枢神经系统（主要指分布于室管膜下、纹状体、海马齿状回、侧脑室下带等部位）中分离培养获得。但是上述方法存在诸多伦理和安全性问题，并且细胞数量受限，批次间存在极大差异。这在一定程度上限制了神经干细胞的移植应用。因此，急需寻找其它替代方案获得安全和疗效稳定的神经干细胞。

多能干细胞（PSC）代表了一种有前途的干细胞替代来源，主要是因为它们具有很强的自我更新和分化能力，人诱导多能干细胞（iPSC）是从成人体细胞人工诱导的多能干细胞，克服了与使用胚胎干细胞相关的伦理问题。通过iPSC诱导特异性脊髓神经干细胞，区别于既往脑源神经干细胞，将具有细胞来源稳定、细胞成分和功能均一可控的优势，从而克服在脊髓修复过程中干细胞药物供给不足和质量不稳定的问题。

发明内容

为了有效克服上述不足，本发明专门开发出一种高效的针对脊髓神经干细胞的诱导体系，通过本体系能特异性的生成针对颈段脊髓的神经干细胞，从而为治疗颈段部位的脊髓损伤提供了可能性。

第一方面，本发明要求保护一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法。

本发明要求保护的从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法，可包括如下：

第1天：将诱导多能干细胞置于诱导培养基1中培养；所述诱导培养基1中含有的诱导分子为Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin；

第2-3天：将第1天培养后的细胞转入诱导培养基2中培养；所述诱导培养基2中含有的诱导分子为CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin；

第4天：将第3天培养后的细胞转入诱导培养基3中培养；所述诱导培养基3中含有的诱导分子为Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）；