[发明专利]2-戊酰基苄腈还原酶突变体及在制备光学纯丁苯酞中的应用

说明书

本发明涉及2‑戊酰基苄腈还原酶突变体及在制备光学纯丁苯酞中的应用，具体是一种活性、稳定性和对映选择性提高的2‑戊酰基苄腈还原酶突变体，其编码的基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化子，以及利用所述2‑戊酰基苄腈还原酶突变体作为催化剂用于催化2‑戊酰基苄腈化合物的不对称还原，特别是催化2‑戊酰基苄腈不对称还原以制备光学纯的正丁基苯酞(丁苯酞)的应用。与现有技术相比，本发明具有酶促反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种催化性能明显提高的2-戊酰基苄腈还原酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该2-戊酰基苄腈还原酶突变体或重组2-戊酰基苄腈还原酶突变体催化剂催化2-戊酰基苄腈化合物，制备光学纯丁苯酞中的应用。

背景技术

正丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)又名丁苯酞，为我国自主研发的治疗脑梗死的国家一类新药。研究发现NBP可阻断脑梗死所致脑损伤的多个病理环节，具有较强的脑保护作用。NBP可明显缩小实验动物局部脑梗死的梗死面积，改善脑能量代谢，促进缺血脑区的微循环和血流量，减轻脑水肿，抑制神经细胞凋亡等作用。NBP持续治疗或序贯治疗有改善神经功能损伤的效果，被列入《中国急性缺血性脑卒中的诊疗指南2014》(Ⅱ级推荐，B级证据)。因此，合成高光学纯度的正丁基苯酞具有重大的经济价值。

dl-NBP是一种外消旋化合物，由于呋喃环上的手性碳原子，它可以被分离成d-和l-异构体。与许多其他光学异构体一样，d-NBP和l-NBP之间的药理活性存在显著差异。据报道，l-NBP作为抗血小板药物比d-NBP和dl-NBP更有效，在减少细胞色素c释放抑制缺血损伤后的DNA断裂方面，其表现优于两倍剂量的dl-NBP。此外，l-NBP在减少脑梗死体积和减轻认知缺陷方面优于d-NBP和dl-NBP。这些差异可能是由于药物分子的立体选择性，并最终体现在药理学、毒理学和药代动力学的性质上。目前，随着人们对单一对映体的手性分离和分析越来越重视，许多现有药物已经从外消旋混合物转变为其异构体之一。在这种情况下，l-NBP具有更好的体内药理活性，在未来更有可能拥有更广阔的市场。

李绍白等将邻苯二甲酸酐和正戊酸酐在无水乙酸钠存在下300℃回流反应，得到3-丁烯基苯酞，随后使用Pd/C还原制得丁苯酞，收率分别为25％，95％，此方法涉及到高温，不利于工业化生产，收率也较低。杨华等用格氏试剂与无水CdCl₂制备镉试剂，在乙醚中与邻苯二甲酸酐反应，再经NaBH₄还原制得丁苯酞，收率42.7％，纯度99.5％。此方法收率不高，且镉试剂毒性较大。陈孝康等将邻溴苯甲酸甲酯制成格氏试剂，后与正戊醛回流反应并发生分子内环化，一锅法制得丁苯酞，收率83.4％，此反应收率较高，产物需要减压蒸馏纯化；格氏试剂的制备是本方法的关键，操作中要保证绝对无水，镁粉的活化也很关键。Kuethe等使用邻碘苯甲酸甲酯与异丙基氯化镁-氯化锂在-50～70℃反应，后加入正戊醛室温反应，以82％的收率制得丁苯酞，此反应第一步需要在低温反应，产物需要柱层析纯化。Suchand等使用Pd催化的环境友好的羰基化反应，在醋酸钯和氧化银存在下，以TBHP水溶液为氧化剂和溶剂，将邻碘苯甲酸乙酯和戊醛偶联得到邻戊酰基苯甲酸乙酯(65％)，后在CeCl₃存在下经NaBH₄还原、分子内关环得到丁苯酞，收率78％。

综上，可以看出，关于丁苯酞的合成，目前有多种反应路线，各有利弊。大部分路线都是以含苯环的化合物为原料，通过构建酯环或引入丁基来进行制备，而且大都使用金属试剂如格氏试剂、烷基锌试剂等。以上几种途径虽然都可以制备NBP，但是这些反应的底物转化率较低，生成的药物产品的ee值也不高，实际应用有限。