[发明专利]植物叶片原生质体的快速制备和转化方法、试剂盒及应用

权利要求书

1.植物叶片原生质体的快速制备和转化方法，其特征在于，所述方法中采用了一种原生质体制备及转化试剂，所述试剂包括WQ1酶解液、WQ2保存液、WQ3重悬液和WQ4转化液，所述WQ1酶解液由1.5％(w/v)的纤维素酶R-10、0.5％(w/v)的离析酶R-10、500mM的D-Mannitol、20mM的MES、10mM的KCl、5mM的CaCl₂·2H₂O、0.2％(w/v)的BSA以及无菌超纯水组成，所述WQ1酶解液的pH值为5.6～5.8，在-80～-20℃长期保存；所述WQ2保存液由154mM的NaCl、125mM的CaCl₂·2H₂O、0.2mM的MES、5mM的KCl、2mM的蔗糖以及无菌超纯水组成，所述WQ2保存液的pH值为5.6～5.8，过滤除菌后在-80～-20℃长期保存；所述WQ3重悬液由20mM的MgCl₂·6H₂O、400mM的D-Mannitol、1mM的MES以及无菌超纯水组成，所述WQ3重悬液的pH值为5.6～5.8，过滤除菌后在-80～-20℃长期保存；所述WQ4转化液由100mM的CaCl₂·2H₂O、200mM的D-Mannitol、2mM的MES、40％(w/v)的PEG4000以及无菌超纯水组成，所述WQ4转化液的pH值为5.6～10.0，所述WQ4转化液可现配现用，也可在4℃下有效保存两天；所述方法包括以下步骤：

(1)酶解：从正常生长的植物中剪取1块叶面积为1cm²的平展叶片，将叶片上表皮一侧固定于无弹性的硬质胶带，用胶带或精细镊子撕去下表皮，去除叶片周围多余的胶带，将粘附叶片的胶带浸没于含有600μL WQ1酶解液的2mL无菌圆底离心管；将离心管固定至转速为45rpm、温度为24～28℃的摇床，避光摇动酶解20～30min，期间每隔5～10min拿出离心管手动轻摇5～10s；用镊子取出胶带，将离心管置于离心机中，在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心1～2min；轻缓吸除上清，沉淀为未经纯化的原生质体；

(2)纯化：向步骤(1)收集原生质体的离心管中，沿管壁缓慢加入2mL WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体；在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心1～2min；轻缓吸除上清，沿管壁缓慢加入2mL WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体；在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心1～2min；轻缓吸除上清，沿管壁缓慢加入1mL WQ2保存液，轻摇重悬原生质体，在冰上静置30min，轻缓吸除上清，沉淀为纯化的叶片原生质体，在显微镜下检查原生质体状态；

(3)重悬：将纯化后的原生质体，在温度为4℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心1～2min，沉淀原生质体；轻缓吸除上清，加入100～200μL WQ3重悬液重悬原生质体，调整原生质体密度至最优，在冰上静置5～10min；

(4)转化：沿离心管管壁向步骤(3)重悬后的原生质体中加入10～20μL纯化后浓度为1～3μg/μL的质粒，轻摇混匀；沿管壁缓慢匀速加入110～220μL的WQ4转化液，迅速轻摇混匀；在24～28℃环境下避光孵育3～5min；沿管壁缓慢加入1mL的WQ2保存液，缓慢颠倒离心管混合样品以终止转化；

(5)漂洗：将终止转化的原生质体混合液在温度为24～28℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心1～2min，沉淀原生质体；轻缓吸除上清，沿管壁缓慢匀速加入2mL WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体；在温度为24～28℃、离心力为100g、升速为3、降速为3条件下离心1～2min，沉淀原生质体；轻缓吸除上清，沿管壁缓慢匀速加入2mL WQ2保存液，缓慢颠倒离心管重悬原生质体；去除上清，保留沉淀，沿管壁缓慢匀速加入500μL WQ2保存液，轻摇混匀；

(6)培养：将经步骤(5)漂洗后的原生质体，在温度为24～28℃条件下避光静置培养12～48h，在荧光显微镜下观察分析。

2.根据权利要求1所述的植物叶片原生质体的快速制备和转化方法，其特征在于，所述步骤(1)中为获得更多原生质体，每增加1张叶片，则增加600μL WQ1酶解液。