[发明专利]一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法

说明书

本发明涉及一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法，包括样品处理液、漂洗液、洗脱液、磁珠悬浮液、PCR buffer、引物组、酶反应混合液，解决了RNA易降解难题，操作简便，兼顾了各组分之间的兼容性，试剂盒可使受检样本通过样品处理获得稳定、完整的靶向RNA复合物，富集后的RNA复合物可直接用于后续端粒酶逆转录酶亚基hTERT mRNA基因的检测，试剂盒中在直扩酶反应体系中可将实验周期控制在30分钟以内，实现全自动化检测，本试剂盒的检测方法可灵敏的检出生物样本中hTERT mRNA的基因存在，该方法可在临床上用来对90％以上存在端粒酶活性的癌细胞进行定性及定量检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学、医学检验技术领域，特别涉及一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法。

背景技术

端粒是染色体末端由重复序列DNA和蛋白质组成的特殊结构,其DNA序列高度保守，在细胞增殖及衰老等过程中发挥重要作用。端粒可减少染色体末端缩短，亦可避免相邻染色体末端融合，随着细胞复制次数的增多,端粒长度逐渐变短,当达到某一临界点时,使细胞退出周期并开始衰老，当端粒长度缩短到伤害DNA的临界值而细胞又无法补偿此长度缩短时，染色体稳定性变差，最终导致细胞死亡、机体衰老。

端粒酶是一种核糖核蛋白复合体,是一种特殊的逆转录酶,当其激活时,能以其自身的RNA为模板合成端粒DNA,可阻止端粒的丢失,维持端粒的长度,使细胞发展成为永生态细胞或癌细胞。在超过90％的永生化细胞和癌细胞中可检测到端粒酶活性,但在大多数正常体细胞中检测不到,这表明在永生化和癌变形成过程中端粒酶的激活是重要事件。

端粒酶由3个亚单位构成,即端粒酶RNA(hTR),端粒酶结合蛋白(TP1)和催化亚单位(hTERT)。端粒酶催化亚单位(hTERT)是端粒酶活性的决定关键部分,它的过度表达在细胞永生化和人类恶性肿瘤的发生、发展中起关键作用，因此端粒酶可以作为组织癌变及癌前病变的有效标志物。

目前，检测端粒酶活性最常用的方法分为直接检测端粒酶(蛋白及RNA的结合复合物)的活性和间接检测端粒酶(催化亚基的mRNA量)的活性。直接检测端粒酶(蛋白及RNA的结合复合物)的活性时主要检测它是否可以延伸DNA模板，然后跑胶或者探针杂交，检测DNA延伸的长度，以此来判断端粒酶的活性高低，该方法需要提取蛋白，操作较复杂，灵敏度不高；放射性同位素标记；重复性差、周期长。间接检测端粒酶(催化亚基的mRNA量)的活性灵敏度高，操作相对简便；但是在多数细胞中，端粒酶催化亚基的表达很难检测到。

传统的RNA检测试剂存在试剂兼容性问题，试剂残留的各种影响PCR扩增的抑制剂导致痕量的RNA样本很难被检出。同时繁杂的实验步骤会造成样本中RNA被RNA酶所降解，导致检测失败。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法，以解决上述技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种端粒酶活性基因检测试剂盒用引物组，包括上游引物，所述上游引物序列号包括：

Forward primer1：CTGGACGATATCCACAGGGC

Forward primer2：TGTCAAGGTGGATGTGACGG

Forward primer3：GTGGCACGGCTTTTGTTCAG

Forward primer4：GTGGCACGGCTTTTGTTCAG

Forward primer5：CAAGCTGTTTGCGGGGATTC

Forward primer6：CATCAGGGGCAAGTCCTACG

Forward primer7：AAACCTTCCTCAGCTATGCCC