[发明专利]一种介导基因敲降的石斑鱼GU6-1启动子及其应用

说明书

本发明公开了一种介导基因敲降的石斑鱼GU6‑1启动子，所述石斑鱼GU6‑1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了所述石斑鱼GU6‑1启动子在介导基因敲降中的应用。本发明提供了一个可高效地介导基因敲降的石斑鱼U6启动子及其在RNAi方面的应用。GU6‑1启动子可以高效、稳定、持续、安全地表达shRNA诱使基因沉默，为鱼类甚至其他动物的基因功能研究、品种改良及病害控制等问题提供了可靠的新工具和技术平台。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种介导基因敲降的石斑鱼GU6-1启动子及其应用，尤其是涉及一种可高效地实现基因敲降的石斑鱼U6启动子及其在基因敲降中的应用。

背景技术

RNA interference(RNAi)过程是指外源的dsRNA在机体内通过酶的剪切作用，形成可以与靶标基因mRNA特异性结合的siRNA，mRNA与siRNA结合后，机体会将该结合物视为异物进行降解，从而阻断翻译过程，属于转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)的一种形式。RNAi的具体分子机制过程最早发现于一些远古生物中，在进化上十分保守，主要分为三部分：起始阶段、效应阶段及扩增阶段。由于RNAi有着特异沉默靶基因的特点，且siRNA易合成、操作简单、效率高等优点，使得RNAi成为基因功能研究的最佳工具之一。目前，RNAi主要应用在基因功能、通路机制、病害防治和基因治疗研究等方面。

siRNA的制备方法主要有两种，一是化学合成dsRNA以及体外转录siRNAs，然后经注射、转染等方式进入生物体内发挥沉默作用。虽然这种方法对靶标基因的沉默效率较高，但RNAi在生产实践应用时需要大量的siRNAs，受限于经济成本，化学合成及体外转录很难达到需求。二是构建siRNA表达载体，将启动子与特殊结构的短发夹RNA(short hairpinRNA，shRNA)连接于同一个表达载体上，借助启动子的转录功能持续转录出shRNA；shRNA在机体细胞内经过一系列的加工处理后形成siRNA，实现RNA干扰的目的。siRNA表达载体作为体内表达siRNA的一种方法，能够持续转录siRNA，具有沉默效率高和作用时间长等优点，弥补了化学合成及体外转录siRNA的不足。然而，siRNA表达载体的转录效率十分依赖启动子的转录能力。目前siRNA表达载体的启动子以RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymerase III,RNA PolIII)启动子如U6、H1等为主，其中U6启动子运用最为广泛。

U6启动子最早被发现为编码剪切体的U6 snRNA元件，其转录过程非常严格，有着明确的起始转录位点以及保守的终止序列，即该启动子总是在其下游某一位置开始转录RNA，直至转录序列中存在4-5个连续的U碱基便终止转录。正是由于U6启动子转录的严格性以及基因沉默的高效性，其在RNAi技术的siRNA表达载体环节中占据了主导地位，