[发明专利]一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该工程益生菌是以益生菌大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle 1917，EcN)为出发菌株，将软骨素合成酶基因(KfoC)和UDP‑葡萄糖胺异构酶基因(KfoA)转入至E.coli Nissle 1917，并敲除E.coli Nissle 1917的KfiA基因和KfiC基因而获得的，该工程益生菌实现了软骨素多糖的合成与分泌，可将其用于发酵生产软骨素，同时本发明进一步优化了分批补料发酵的方式，使软骨素多糖的产量提高了30倍，为后续软骨素多糖的大规模纯化与硫酸化修饰奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用。

背景技术

硫酸软骨素是一类酸性糖胺聚糖类大分子粘多糖，多以蛋白聚糖侧链的形式广泛存在于动物结缔组织中，特别是软骨、皮肤、血管、韧带和肌腱中。其结构如图1所示，β-1,3糖苷键交替连接葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以形成重复二糖单元，二糖单元间通过β-1,4糖苷键连接组成硫酸软骨素及软骨素的碳链骨架，一般二糖单元有20～100个。硫酸软骨素是经软骨素硫酸化后得到的，软骨素按其硫酸化位置可划分为多种类型。硫酸软骨素A(CS A)、硫酸软骨素C(CS C)分别在C-4位、C-6位羟基上进行硫酸化；硫酸软骨素E在GalNAc的C-4位和C-6位的羟基都会硫酸化；硫酸软骨素B(CS B)的结构是硫酸软骨素A中GlcA的C-5异构化为L-艾杜糖醛酸(IdoA)。其中，动物来源的硫酸软骨素多为CS A和CSC。

硫酸软骨素在治疗风湿病、骨质疏松症、关节炎、腰间盘突出等方面具有重要作用。在欧美、日本等国家，硫酸软骨素被广泛用于防治心脑血管疾病、动脉粥样硬化、骨关节炎等。硫酸软骨素常与氨基葡萄糖配合使用，可以刺激软骨细胞的增殖以及PGs、Ⅱ型胶原、透明质酸的生物合成，从而缓解骨关节炎患者疼痛、减少关节肿胀和积液，对改善关节功能、治疗骨关节炎具有较好的疗效。硫酸软骨素还有其他多种药理活性，如抗病毒感染、保护黏膜、促进细胞代谢、加速伤口愈合等。硫酸软骨素除了具有多种药理活性，还可以作为保健品、食品中的添加剂，在食品加工、化妆品、临床医学等领域具有广泛的应用开发前景。

商业化硫酸软骨素主要以鲨鱼软骨、气管、鼻中隔等为来源，采用碱法、酶法等提取方法进行工业化生产。提取、除蛋白、酶解、沉淀干燥等是浓碱法提取硫酸软骨素的主要步骤，而酶法提取则经过酶解、活性炭吸附、醇沉、除杂等流程。目前我国在硫酸软骨素的生产中仍面临结构不均匀、原材料不稳定、容易受到动物源致病微生物及硫酸角质素污染等问题，已经难以满足现代规模化高质量生产硫酸软骨素的需求。此外，现在大多数研究都是利用大肠杆菌K4(E.coli K4)发酵制备软骨素，由于软骨素结构类似物在大肠杆菌K4(E.coli K4)的细胞表面以荚膜多糖的形式存在，因此可以通过发酵培养获得软骨素结构类似物，然后通过对发酵所得软骨素进行硫酸化修饰，进而制备硫酸软骨素。大肠杆菌K4(E.coli K4)荚膜多糖属于Group 2类，其荚膜多糖合成基因簇包括Region 1、Region 2、Region 3这3个主要功能区，3个功能区共同完成多糖链合成及运输。Region 2包含7个基因(kfoABCDEFG)，直接参与血清型特异性多糖的合成，并编码负责UDP糖前体生物合成最后步骤的酶，以及聚合物的组装和果糖基化。kfoA基因编码UDP-葡萄糖差向异构酶，能够将UDP-GlcNAc异构为UDP-Gal Nac；kfoC基因编码软骨素合成酶，通过与前体UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰半乳糖胺结合并运送至多糖链的非还原末端，重复此过程使多糖链不断延伸，形成软骨素碳链骨架。但是，大肠杆菌K4(E.coli K4)中分离出的K4荚膜多糖，其软骨素碳链骨架的葡萄糖醛酸残基C-3位连有一个果糖分支，如果以K4荚膜多糖为软骨素碳链骨架合成硫酸软骨素，需去除果糖分支，会导致碳链骨架结构完整性受到破坏，并使软骨素产量严重下降。而且，大肠杆菌K4是致病菌，分泌的毒性因子容易造成产品污染，而去除这些毒性因子将极大增加纯化成本。