[发明专利]非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗原表位肽、针对该抗原表位肽的单抗克隆抗体及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟p72蛋白的抗原表位肽、针对该抗原表位肽的单抗克隆抗体及其应用。本发明通过将非洲猪瘟病毒p72基因克隆至原核表达载体pET‑30a中，构建出原核表达载体pET‑30a‑p72，表达并纯化得到p72重组蛋白。将p72重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合获得杂交瘤细胞，应用间接ELISA方法筛选获得抗p72重组蛋白的单克隆抗体，并鉴定了该抗体所对应的p72蛋白的抗原表位肽为非洲猪瘟病毒p72蛋白20～39肽段，其氨基酸序列为supgt;20/supgt;ILAQDLLNSRISNIKNVNKSsupgt;39/supgt;。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟p72蛋白的抗原表位肽、针对该抗原表位肽的单抗克隆抗体及其应用。

背景技术

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swinefever Virus, ASFV）引起的一种急性、热性、烈性传染病，致死率高达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前尚未有商品化疫苗可用，早发现、早诊断、早处置、提高生物安全管理水平是目前非洲猪瘟防控的主要措施。

ASFV是一种核质双链DNA病毒，呈二十面体结构，基因组长度为170～193kkb，有150～167个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，从外至内组成依次包括外囊膜蛋白、衣壳蛋白、内囊膜蛋白、内核芯壳蛋白及病毒的基因组。外囊膜蛋白由CD2v、p24、p12等构成，其中，CD2v蛋白介导红细胞吸附，可为ASFV的诊断提供重要依据。衣壳蛋白主要包括一个主蛋白p72，由B646L编码。p72蛋白是ASFV最主要的结构蛋白，约占病毒总质量的31～33%，变异小，具有很强抗原性和免疫原性，是诊断非洲猪瘟的理想标靶分子。

发明内容

本发明采用细胞融合技术，通过亚克隆筛选，成功获得了一株特异性针对p72蛋白的单克隆抗体，并进行了抗原表位鉴定，发现能识别ASFV p72蛋白的肽段（²⁰ILAQDLLNSRISNIKNVNKS³⁹），对该肽段进行保守性分析发现不同的毒株高度保守，不仅为p72蛋白结构、功能解析提供了有价值的信息，而且为ASFV疫苗的设计提供参考，为ASFV的诊断提供了重要材料。

本发明具体采用以下技术方案：

将非洲猪瘟病毒p72基因克隆至原核表达载体pET-30a中，构建出原核表达载体pET-30a-p72。将pET-30a-p72转化至感受态细胞BL21中，诱导表达p72重组蛋白并对其进行纯化以获得纯度较高的蛋白。将纯化的p72蛋白免疫Balb/c小鼠，待抗体效价达标时，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，从而获得杂交瘤细胞，应用间接ELISA方法筛选特异性针对非洲猪瘟病毒p72蛋白的阳性杂交瘤细胞株。

本发明将扩大培养的杂交瘤细胞注射Balb/c小鼠腹腔，收集腹水，纯化，得到ASFVp72蛋白单克隆抗体。对ASFV p72蛋白单克隆抗体进行抗体亚型的鉴定，分析该抗体重链为IgG2a，轻链为Kappa链。

本发明还通过截短表达非洲猪瘟病毒p72蛋白，确定筛选阳性杂交瘤细胞所针对的抗原表位肽为非洲猪瘟病毒p72蛋白20～39肽段，其氨基酸序列为²⁰ILAQDLLNSRISNIKNVNKS³⁹。

本发明的有益效果为：