[发明专利]一种抗IL4i1纳米抗体的制备及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗IL4i1纳米抗体的制备及其应用。本发明提供的抗IL4i1纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，共筛选出9条抗IL4i1纳米抗体的序列。本发明还提供了编码上述纳米抗体或其VHH链的编码序列、相应的表达载体和能够表达该纳米抗体的宿主细胞，以及本发明抗IL4i1纳米抗体的生产方法。本发明提供的纳米抗体对IL4i1具有特异的识别和结合能力，具有特异性强、灵敏度高等优势；同时有效地降低了IL4i1抗体的开发和生产成本，缩减了抗体表达时间。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗IL4i1纳米抗体的制备及其应用。

背景技术

白细胞介素-4诱导基因1 (IL4I1)是一种由抗原提呈细胞表达的L -苯丙氨酸氧化酶。在体外，IL4I1抑制T细胞增殖和细胞因子的产生，促进naïve CD4+ T细胞分化为调节性T细胞，有一部分原因依靠其产生H2O2和从T细胞微环境中消耗苯丙氨酸的能力。IL4I1在大多数人类肿瘤类型的肿瘤床中都能强烈地检测到，在某些情况下，如某些B细胞淋巴瘤，它是由肿瘤细胞本身表达的。局部产生IL4I1通过抑制抗肿瘤CD8+ T细胞的增殖和功能，改变肿瘤微环境中免疫细胞向免疫抑制人群的平衡，促进小鼠模型中肿瘤的生长。此外，IL4I1在细胞中表达的位置和密度与患者变差的临床参数相关，并倾向于导致黑色素瘤患者更短的生存期。研究者还发现，IL4I1蛋白或mRNA的存在与肾癌、神经胶质瘤、结肠癌和乳腺癌预后质量有关。这些数据都表明，旨在抑制肿瘤患者IL4I1表达或降低其活性的治疗策略可能会提高肿瘤患者的免疫控制。而且这种策略似乎不伤害宿主，因为有研究表明KO小鼠中IL4I1的缺失似乎不会导致特定的病理或过早死亡。因此，靶向IL4I1可能会是一种新的肿瘤免疫治疗策略。在Cell杂志发表的一项研究中，来自德国癌症研究中心（DKFZ）和柏林健康研究所（BIH）的科学家们发现，肿瘤中大量产生的一种代谢酶IL4I1（Interleukin-4-Induced-1）能促进肿瘤细胞的扩散并抑制免疫系统。他们的研究表明IL4I1是一种代谢免疫检查点，IL4i1抑制剂在将来有可能会为癌症治疗带来新的机遇。

纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。

因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。

噬菌体展示技术是一种将多肽或蛋白质展示在噬菌体的表面，从而将所需性质的多肽或蛋白质进行体外筛选的技术。将编码目的蛋白的基因融合到噬菌体衣壳蛋白的基因之中，就能使目的蛋白展示在噬菌体的表面，从而将基因型和表型联系起来。随后，在体外进行几轮亲和筛选（如生物淘选）得到一些噬菌体克隆，再将这些噬菌体克隆扩增，进行更多轮的筛选，便可进一步得到特异性较强的目的蛋白。

目前最广泛使用的单细胞分析技术是高通量单细胞RNA测序（Single-cell RNAsequencing , scRNA-seq）。自动化的高通量单细胞RNA测序技术可以提供一种无偏见和高效的方法对单细胞转录组进行高通量检测，以获得微环境的单细胞转录组图谱。基于液滴的高通量单细胞RNA测序技术出现，可以将单次检测细胞数量提高到上万个，真正实现了高通量检测。因此，高通量的单细胞RNA测序技术的实现依赖于微流控自动化技术和高通量测序技术的应用，前者实现高通量的单细胞分离而后者实现自动化的DNA测序。