[发明专利]一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法

权利要求书

1.一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）藻种及其保藏：所使用的藻种为小球藻，使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中，之后放置于-80℃冰箱保藏；

（2）平板培养：取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上，并置于25-35℃的培养箱中避光培养4-8天；

（3）种子培养：使用接种环从平板中挑取1-4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中，置于25-35℃摇床培养箱中，设置转速为50-300 r/min，避光培养3-7天；

（4）发酵培养：

1）第一阶段：将步骤（3）的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中，控制细胞初始浓度为0.5-3.0 g/L，通气量控制在0.5-2.0 vvm，初始转速控制在100~300 rpm，温度控制在25~35℃，pH控制在6.5~8.0；

2）第二阶段：当初始葡萄糖浓度耗尽时，开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液，控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间；每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时，补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度；溶氧与转速关联控制在10-30%；

3）第三阶段：当藻体生物量浓度达160-200 g/L时，固定发酵罐最大转速，改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液，使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动，以控制培养液中残糖浓度接近于零，从而诱导蛋白质和叶黄素合成；总发酵周期6-8天。

2.根据权利要求1所述的一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：所述小球藻为Chlorella sorokiniana FZU60，保藏编号为CGMCC NO. 45230，已于2022年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3.根据权利要求1所述的一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：步骤（2）和（3）中，固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L；种子培养基为：葡萄糖10 g/L，硝酸钠1.75 g/L，氯化钠5 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.6 g/L，二水氯化钙0.15 g/L，三水磷酸氢二钾0.1 g/L，Tris 0.5 g/L，EDTA·2Na 75 mg/L，硼酸15mg/L，七水硫酸亚铁5 mg/L，四水氯化锰3.5 mg/L，七水硫酸锌0.825 mg/L，六水硝酸钴0.0175 mg/L，五水硫酸铜0.005 mg/L。

4.根据权利要求1所述的超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：步骤（4）中，发酵培养基为：葡萄糖30 g/L，尿素1.855 g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，二水氯化钙0.45 g/L，三水磷酸氢二钾0.3 g/L，EDTA·2Na 213 mg/L，硼酸45 mg/L，七水硫酸亚铁15 mg/L，四水氯化锰10.5 mg/L，七水硫酸锌2.475 mg/L，六水硝酸钴0.0525 mg/L，五水硫酸铜0.015 mg/L。

5.根据权利要求1所述的超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：步骤（4）中，浓缩液分为3部分，浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L，浓缩液II为尿素247.33g/L和七水硫酸镁160 g/L，浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30 g/L、硼酸6g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。

6.根据权利要求1所述的超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：步骤（4）中，第三阶段的培养时间为1-2天。