[发明专利]一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbUR5GT及其应用

说明书

本发明公开了一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbUR5GT及其应用。本发明以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbbHLH2的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，获得了IbbHLH2基因的上游调控因子IbUR5GT。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbbHLH2启动子与上游调控因子IbUR5GT之间存在相互作用。本发明在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

技术领域

本发明涉及植物遗传与变异的分子机制领域，具体涉及一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbUR5GT及其应用。

背景技术

目前，对于植物的花、果、茎、叶等地上部分花色素苷合成以及环境信号因子影响的分子机制有了一定的认识，尤其是光照对花色素苷合成的调控机制及信号传导过程已比较清楚。对于非依光型或无法直接接受光照的植物根、块根或块茎中花色素苷合成调控机制及信号传递过程却不甚明了。

调控花色素苷生物合成的转录因子主要有三类：MYB、bHLH、WD40。其中，bHLH(basic helix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋)转录因子是植物中的第二大转录因子超家族，仅次于MYB转录因子(Jin et al.,2014)。bHLH结构域是高度保守的，包含约60个氨基酸，具有两个功能不同的区域。典型的bHLH结构域在其N端包含13-17个碱性氨基酸，称为碱性区域，该区域能够识别靶基因启动子序列上的顺式作用元件E-Box(5’-CANNTG-3’，其中N代表任意氨基酸)(Feller et al.,2011)；C端大约40个氨基酸，是一个由可变长度的环区连接2个两亲性的α-螺旋共同构成的一个螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)区域。bHLH转录因子可依赖HLH区域中的疏水氨基酸之间的相互作用形成同型或异型的二聚体(Massari and Murre et al.,2000；Castilhos et al.,2014)。研究表明，高度保守的Leu-23残基对于人MAX和拟南芥PAR1蛋白中bHLH二聚体的形成在结构上是必需的，而后者也需要保守的Leu-52残基(Brownlie et al.,1997；Carretero-Paulet et al.,2010)。另外，研究表明，某些蛋白质的bHLH结构域也能够与非bHLH蛋白质相互作用，其中的某些氨基酸可能决定了蛋白质与蛋白质相互作用的特异性(Massari and Murre et al.,2000；Ciarapica et al.,2003)，而对于bHLH转录因子建立二聚体的详细机制将需要开展更多的研究来深入精确地了解。

本发明人研究团队在紫心甘薯中克隆获得了转录因子IbbHLH2的基因序列，并采用洋葱表皮瞬时表达法对这些转录因子基因进行了表达产物的亚细胞定位，通过拟南芥转化实验，证明其位于细胞核内且其表达量与花色素苷含量的变化趋势相一致(Fu Danwen；Hui Yake；Li Haihang；Yang Shaohua；Chen YaHui；Gao Feng*.Molecular Cloning andFunctional Analysis of the Gene and Promoter of IbbHLH2 from Purple-FleshedSweet Potato.HORTICULTURAL SCIENCE and TECHNOLOGY,2021,40(1).)。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯IbbHLH2转录因子表达的上游调控因子。

为了解决上述技术问题，本发明首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。

进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbbHLH2的启动子DNA片段，并将启动子IbbHLH2构建到pAbAi载体中，扩增IbbHLH2的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：