[发明专利]一种融合蛋白及其应用

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由引导肽、促表达肽、酶切位点和胰岛素前体依次连接而成，

所述促表达肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述酶切位点选自K；

所述胰岛素前体由经修饰的胰岛素B链、C肽、经修饰的胰岛素A链依次连接而成；

经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；

所述C肽选自如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽；

所述引导肽选自如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的多肽。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列选自SEQID NO.11 ~ SEQ ID NO.14中的一种。

3.一种编码权利要求1或2所述融合蛋白的多核苷酸片段。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸片段，其特征在于，所述多核苷酸片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.15 ~ SEQ ID NO.18中的一种。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3或4所述的多核苷酸片段。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组pET-30a(+)表达载体。

7.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌包含权利要求5或6所述的表达载体，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)。

8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：

（1）合成如权利要求3或4所述的多核苷酸片段；

（2）将所述多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

（3）将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌。

9.一种制备权利要求7所述的重组大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）合成如权利要求3或4所述的多核苷酸片段；

（2）将所述多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

（3）将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌，冻存备用。

10.一种制备长效酰化胰岛素衍生物的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

（1）培养如权利要求7所述的重组大肠杆菌工程菌，表达所述融合蛋白；

（2）所述融合蛋白经变性、复性和酶切，得到胰岛素类似物；

（3）在所述胰岛素类似物上连接脂肪酸侧链，获得所述长效酰化胰岛素衍生物。